为啥你的PCR实验又双叒叕失败了？_技术文章

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为啥你的PCR实验又双叒叕失败了？
阅读次数：308 发布时间：2022/9/28 10:25:24

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先，让我们来回忆一下PCR鉴定的整个过程，主要包括样本处理、配PCR体系、扩增、PCR产物电泳四个部分，接下来我们就从这几个部分盘点PCR操作中的那些坑，请收下这份防坑指南。

1.样本处理
PCR的第/一个步骤就是处理样本，这一步出问题后面的也就废了。取样后，如果不能马上处理样本，短期放4℃保存，长/期放﹣20℃保存；此外，加完裂解液，要注意检查样本是否完/全浸没在裂解液中。

2.PCR体系
简而言之，PCR体系的要求就是“加对成分加对量”，就好比做一道菜，缺了任何一种材料或者量不合适，味道就不一样了，而对PCR而言，缺了任何一种成分或者量不对，你就别想看到漂亮的目标条带了。所以配体系的时候一定要心,不要分心思考类似于/天中午吃什么这种哲学问题，注意所有的成分是否加对了，每种成分的量是否加对了。例如，酶的量很少，吸取的时候要注意有没有吸到。

3.PCR扩增
就扩增而言，关键是要设计对程序，主要就是退火温度及延伸时间。
退火温度根据引物的Tm值而定，延伸时间按所用的酶来计算。

4.PCR产物电泳
终于到了令人激动的时刻，扩增好就可以进行琼脂糖凝胶电泳出结果了。当然，在做之你得提把胶配好，胶的质量好坏也会影响结果。这个环节需要注意的就是选择合适的胶浓度，胶溶解加热时不要过久，水分蒸发过多浓度改变，但同时要保/证胶溶解彻/底。添加的染液要注意检查是否过期变质。倒好胶后插梳子，注意除去气泡，待胶凝固之后拔梳子要一气呵成，然后给样本加loading buffer，/后就可以上样啦。

这一步我们要注意以下几点：
可以每个孔加一点loading buffer检测胶是否有漏。特别是当你觉得胶可能破了的时候一定要进行验漏；
上样的时候枪头垂直加入，不要戳破胶孔，边加边抽出，防止喷涌出来，注意不要有气泡；
上一个样换一个枪头，防止污染；
电泳液多次使用的话，/好频繁更换，防止污染。

5.设置对照组
生物实验一定要做对照，没有对照就没有说服力，而且设置对照有利于分析PCR鉴定失败的原因。阴性对照及阳性对照所加体系与待测样本一样，只是加的样本分别为无菌水及同个品系野生型小鼠的基因组模板。

阴性对照的意义：若是阴性对照也P出了条带，说明有污染，实验结果不可靠。
阳性对照的意义：如果阳性对照也没P出来，说明体系、条件或是操作有问题。

接下来就给大家分析一下PCR的常见问题以及改进的建议，PCR成功的原因只有一个，而失败的原因却千千万，每个步骤都要细心谨慎，祝大家都能跑出漂亮的条带。

PCR常见问题及建议

1.没有条带

原因1.1 ：样本。样本放置太久失效；样本裂解步骤出问题，比如组织没有浸没到裂解液中；样本有裂解到但是DNA浓度低，跟取样有关，毛发太多组织太少，会导致裂解不出太多DNA。
建议：当然是重新取样提取DNA了，取样大小适中，裂解时注意组织是否完/全浸没到裂解液中。

原因1.2： PCR反应体系。少加酶、引物、dNTP、缓冲液等均会导致目标片段扩增不出来。
建议：配体系加样时，自行开启勿扰模式，心无杂念，心里默念：每种成分都加了吗？量都加对了吗？

原因1.3：操作问题。比如是否把酶放置在冰上，常温放置过久会使酶失活；加各体系的时候，是否有吸取到再加进去。
建议：记住冰在酶在，即使是融酶也要放冰上融，拿手握住酶或是常温放置，被老板看见是要被打的。

2.抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
原因：往往是由于酶量过多或酶的质量差、dNTP浓度过高、Mg2+浓度过高、退火温度过低、或循环次数过多及引物不特异等引起的。
建议：减少酶量或换另一来源的酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；增加模板量；减少循环次数。有效的方法就是提高退火温度，或者更换引物（引物不特异也会造成抹带）。

3.条带比较暗

原因3.1：酶。
建议：条带弱的情况加多酶量，一半都能得到改善。实验表明，PCR酶对DNA具有一定的偏好性，如果使用一种酶经过优化也难以获得理想扩增时，可以尝试别的PCR酶。

原因3.2：模板、引物。
建议：确保模板和引物的品质，保/证没有降解。用合适的试剂盒回收样本，或者进行胶回收得到纯净的DNA样本是不错的选择，或者直接加多模板，提高反应体系中DNA的浓度。

原因3.3：反应体系与条件
建议：增强循环数、降低退火温度、适当升高Mg2+工作浓度，都可以提高扩增效率，但同时会导致特异性下降，需要根据具体的实验要求优化合适的条件。

PCR失败的原因千千万，操作情况因人而异，所以实验小白们在操作时可以请师兄师姐帮忙看一下，他们会发现许多你都注意不到的操作错误，及时纠正过来就好了，不然每次操作都出同样的错误，而自己又不知道错在哪，觉得自己是按着步骤和要求来做的啊，怎么就出问题了，反复操作还是这样，简直让人怀疑人生。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司