Western Blot是生物修炼的一大实验，现在不做定量Western Blot，都不敢自诩学霸的了，暗暗擦汗的有没有？在讨论如何从Western Blot中获得定量数据之，先定义一下我们所说的“定量”是什么意思是非常有用的，何为定量，必须符合下列准则：使用一个定义的过程进行检测，即Western Blot。

这个过程产生一个可重复的结果，即是精/确度。

测量反映了一个“真实”的结果，即是准确度。

定量Western Blot除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，是一定要检测内参的，也就是内部参照（Internal Control），目的是校正蛋白质转印和上样过程中导致的实验误差，保/证实验结果的准确性。对于哺乳动物细胞表达来说，内参通常指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用其作为参照物。

在发表文章时，Western Blot实验结果需内参进行校正，但仍有一些科研人员在实验中忽略内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范是比较各种样品间上样量等同的唯1方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，例如BCA方法对还原性试剂兼容性差，Bradford方法对去垢剂兼容性差，A280方法影响因素比较多，不能完/全准确的确定各种样品的蛋白浓度。在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对转印和上样步骤产生的误差进行校正。

那么如何实现Western Blot实验中内参的检测呢？简单讲就是在WB过程中，除加入靶标蛋白的抗体外，也加入内参蛋白的抗体，同时实现靶标蛋白和内参蛋白的检测。通过归一化，可以校正上样误差和转印误差，从而获得比较准确的Western Blot结果。

使用荧光方法进行定量Western Blot检测，可进行多重检测，荧光信号稳定，持久，影响因素少，不用剥离膜和剪膜，实验条件一致，更容易获得定量Western Blot的数据。Azure600可以同时进行4通道荧光成像，无需剥离和重孵育，靶标蛋白和内参蛋白同时在一张印迹膜上成像，更容易被期刊杂志接收。

如果蛋白表达是高丰度的，可见荧光方法也可以尝试，如果是3色RGB可见荧光，能够同时检测两种靶标蛋白和一个内参蛋白。

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