1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定 5-10 min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。

3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般 10-30 min。

4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃ 、室温、37℃ ，其中 4℃ 效果/佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37℃ 1-2 h，而 4℃ 过宿和从冰箱拿出后 37℃ 复温 45 min。具体条件还要摸索。

5、二抗孵育条件：二抗一般室温或 37℃ 立即观察，若将标本放在聚乙/烯塑料袋中 4℃ 30 min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。/后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用 DAPI 复染。

7、封片：为了长/期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育的清洗是 3 min*3 次，而一抗孵育后的清洗均为 5 次*5 min。注意：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；冲洗的时间要足够，才能彻/底洗去结合的物质。PBS 的 pH 和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议 pH 在 7.4-7.6 浓度是 0.01 M。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

9、拍照：有条件的话/好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2 h 为宜，超过 90 min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射 3~5 min 后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以多不得超过 2~3 h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启 15-30 分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙/烯塑料袋中 4℃ 保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保/证镜油为无荧光镜油；电源/好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

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