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远慕生物分享---测培养细胞中污染的支原体
阅读次数：688 发布时间：2016/9/26 11:17:10

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    远慕生物分享－－-测培养细胞中污染的支原体

    PCR法
    原理该法是通过PCR技术将支原体16srRNA基因特异性扩增，来检测培养细胞中污染的支原体。PCR引物选自16srRNA基因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经溴乙啶（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。

    u16srDNA引物用水稀释至40umol/L。
    （1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
    （2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
    2）PCR扩增
    （1）在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物，对每个样品均加入：
    10XPCR缓冲液5.0ml
    25mmol/LdNTPs混合物0.4ul
    40umol/L16srDNA引物每种引物1.0ul
    40umol/LpBR322DNA引物每种2.0ul
    pBR322DNA1pg/ml2.0ul
    DNA聚合酶（5U/ml）0.2ul
    三蒸水35.4ul
    总量45ul

    （2）用无菌去离子水稀释样品为1:10，1:100。
    （3）于每个eppendorf管中加45ulPCR扩增混合物，每管中分别加入样品原液及1:10，1:100稀释液各5ul，操作均在冰浴中进行。
    （4）在每个eppendorf管中轻轻加入50ul无菌矿物油，覆盖在液面上。如DNA扩增仪带有有制式热盖，此步骤可省略。
    （5）将各管放入DNA扩增仪的孔槽内，并执行以下循环指令：
    ①950C10min一个循环
    ②950C，30S→580C1min→720C1min,共30个循环。
    ③*后720C10min延长循环。

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