上海远慕生物：MTT分析法_技术文章_上海远慕生物科技有限公司

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上海远慕生物：MTT分析法
阅读次数：711 发布时间：2016/10/11 10:53:31

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    MTT分析法

    原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

    实验材料：细胞样品试剂、试剂盒：PBSDMSO胰蛋白酶甘氨酸缓冲液仪器、耗材：加样器96孔培养板酶联免疫检测仪培养板

    具体操作：普通MTT法1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。3、呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。4、比色：选择490nm(570nm)波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

    药物MTT法贴壁细胞：1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。2、5%CO2，37℃孵育，至细胞贴壁，加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，一般是前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实况。3、5%CO2，37℃孵育24-72小时，倒置显微镜下观察。4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5、终止培养，小心吸去孔内培养液。6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm(570nm)处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔即空白组(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

    悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul；②加ActinomycinD(有毒性)10ul用培养液稀释(储存液100mg/ml，需预试寻找*稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml1640)。2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3、每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。(悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后可跳过步骤4)，直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)离心(1000转x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔。

    注意事项：1、选择适当得细胞接种浓度。

    2、避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

    3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，*后比色以空白调零。

    4、MTT实验吸光度*后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

    5、吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3-4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管里面装3-4ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。

    6、吸管的吸液量在1ml左右：吸液量过多，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管，总液量在5ml左右为益。

    7、吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。

    8、吹打次数100左右，就可以吹打均匀了。

    9、向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则会使细胞聚积在底部。

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     注：本公司产品仅供科研使用！

原创作者：上海远慕生物科技有限公司