小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)ELISA试剂盒说明书_技术文章

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小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)ELISA试剂盒说明书
阅读次数：914 发布时间：2016/10/24 15:34:51

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本试剂仅供研究使用
目的：远慕试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)的含量。

实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)水平。用纯化的小鼠抗细胞间粘附分子1抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入细胞间粘附分子1，再与HRP标记的ICAM-1抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的细胞间粘附分子1呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)含量。
试剂盒组成：

试剂盒组成	48孔配置	96孔配置	保存
说明书	1份	1份
封板膜	2片（48）	2片（96）
密封袋	1个	1个
酶标包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
标准品：54ng/L	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
标准品稀释液	1.5ml×1瓶	1.5ml×1瓶	2-8℃保存
酶标试剂	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
样品稀释液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
显色剂A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
显色剂B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
终止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
20倍浓缩洗涤液	20ml×1瓶	30ml×1瓶	2-8℃保存

小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)elisa试剂盒样本处理及要求：
    1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
    2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
    3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
    4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
    5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
    6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
    7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：
    标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在、第二孔中分别加标准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为36ng/L，24ng/L ，12ng/L，6ng/L，3ng/L）。
    加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
    温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
    配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
    洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
    加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
    温育：操作同3。
    洗涤：操作同5。
    显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
    终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
    测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)ELISA试剂盒注意事项：
    试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
    浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
    各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
    请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请*后乘以总稀释倍数（×n×5）。
    封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
    底物请避光保存。
    严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
    所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
    本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司