备注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：200、100、50、25、12.5、6.25ng/ml

【需要而未提供的试剂和器材】
1、37℃恒温箱
2、 标准规格酶标仪
3、 精密移液器及一次性吸头
4、 蒸馏水
5、 一次性试管
6、 吸水纸

【试剂盒操作步骤】
1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。
4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。
7、温育：重复4的操作。
8、洗板：重复5的操作。
9、显色：每孔先加入显色剂A 液50μL，再加入显色剂B液 50μL，37℃避光显色15min。
10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。
11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。
12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。*终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

【样本要求】
1、样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能立即试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3、样本应充分离心，不得有溶血及颗粒。

【试剂盒注意事项】
1、实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。
2、酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。
3、建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测，取平均值，以减小实验误差。
4、牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。
5、本试剂盒定量范围为0.1-200ng/ml，超过此范围，为标准曲线延伸计算所得，不做为准确定量结果，请用特殊稀释液稀释后测定准确结果（0.1-200ng/ml范围内），乘以总稀释倍数即为样本*终浓度。
6、若显色过浅，可适当延长底物温育时间。
7、为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。
8、试剂盒保质期内使用，不同批号的试剂不得混用。
9、底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

【操作程序总结】
准备试剂，样品和标准品
加入准备好的样品和标准品，37℃反应30分钟
洗板4次，加入酶标试剂，37℃反应30分钟
洗板4次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟
加入终止液
15分钟之内读OD值
计算

【检测范围】
0.1-200ng/ml

【试剂盒规格】
96T/盒、48T/盒

【试剂盒贮藏】
2-8℃，避光防潮保存。

【试剂盒有效期】
6个月