远慕生物：细胞培养过程常见问题_技术文章

技术文献

远慕生物：细胞培养过程常见问题
阅读次数：502 发布时间：2016/12/26 15:05:12

分享到：

    细胞培养过程常见问题

    1.为什么培养的细胞要及时传代？

    答：体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长得以继续。

    2.培养液pH下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？

    答：通常细胞生长得非常快时，pH值通常下降得很快。此时可以及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得太紧、NaHCO3缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。

    (1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。

    (2)改用不依赖CO2培养液。

    (3)松开瓶盖1/4圈。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。

    (4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。

    (5)如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。

    3.培养液pH对细胞生长的影响？

    答：由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：培新配的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。

    4.购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？

    答：研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。但对于DMSO敏感的细胞，还是复苏细胞时，用离心去除DMSO比较好。

    5.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

    答：研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，原因比较复杂，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于–80℃太久等。建议严格参照ATCC或ECACC的标准操作规程进行细胞复苏、冻存等工作。

    6.支原体污染会对细胞培养有何影响？

    答：支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数、代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

    7.冷冻保存细胞之方法？

    答：冷冻保存方法一:冷冻管置于4℃(30－60分钟)→-20℃(30分钟)→-80℃(16－18小时或隔夜)→液氮罐长期储存。

    冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至–80℃以下，再放入液氮中长期储存。注意：-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

    8.悬浮细胞应如何继代处理？

    答：一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养瓶中，稀释细胞浓度即可。若培养液太多时可分瓶取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养瓶中，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

    9.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

    答：欲回收动物细胞，其离心速率一般为300×g(约1,000rpm)，5-10分钟，过高之转速过长时间都将造成细胞死亡。合适的离心转速是根据相对离心决定。RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中r为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离；rpm为离心机每分钟的转数；RCF(relativeeentrifugalforce)为相对离心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍数来表示表示单位。

    10.培养细胞时应使用5%还是10%CO2，或者根本没有影响？

    答：一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司