人elisa试剂盒如何进行洗涤,它的显色原理是什么。今天上海远慕为您一一说明。
洗涤 :
洗涤是ELISA不同于均相免疫学检测技术的一大特征,洗涤在整个ELISA反应过程中虽不是一个反应步骤,却非常关键。其目的是去除反应体系中与反应无关的成分,包括未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤液通常为含有一定浓度Tween 20 的缓冲液,Tween 20 是一种非离子去垢剂,既含亲水基团,又含疏水基团,在洗涤中的作用机制是借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基团形成疏水键,从而削弱蛋白分子与固相的吸附。同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下,促进蛋白质分子脱离固相而进入液相,*终被洗脱。必须注意非离子去垢剂的使用浓度,*常用的洗涤液是含0.05 %Tween20,pH为中性的磷酸盐缓冲液,如果洗涤液中的Tween20 超过0.2% ,可使包被于固相上的抗原抗体解吸附而影响实验的测定下限。洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式,手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗板方式如何,在向板内注液时应当避免气泡残留孔内,否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时,要保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净,要求洗板后残液小于2 μL,即人工扣板垫纸不湿,浸泡时间超过45 秒。
显色 :
大多数情况下ELISA商品多选用HRP 和碱性磷酸酶(ALP)。HRP可催化的底物为过氧化氢,参加反应的显色供氢体有邻苯二胺(OPD)、邻联甲苯胺(OT)及四甲基联苯胺(TMB)等。其中OPD 难溶于水,见光易变质,使用前配制,反应过程须避光且OPD有一定毒性。TMB 的反应产物为蓝色,目视对比鲜明,其性质稳定,对人体无毒。若选用各类酸性终止液,则会使蓝色转变为黄色。TMB作底物时的产物检测波长为450 nm ,ALP 作为标记物,其底物一般采用对硝基苯磷酸酯(pNPP),产物为黄色的对硝基酚,吸收波长是405 nm。为了保证结果的稳定性,必须要严格按照试剂盒说明书中规定的温度和时间操作,不可随意改变温度和时间。
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