1. 感染预实验
以 24 孔培养板为例,同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。工具细胞可选择 293T(人胚肾上皮细胞)、H1299(人肺癌细胞)或其它细胞。实验材料:
培养基、24 孔培养板,移液枪,枪头, EP 管,细胞计数板、冰盒、废液缸等。(根据目的细胞情况,可酌情使用 Polybrene)
Day1:
准备细胞:培养细胞至对数生长期,细胞以胰酶消化计数后,用细胞计数测出细胞密度,每孔接种 5×104 个细胞,添加
细胞培养液至 500?L。通常情况下,该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。(接种目的细胞时,请根据细胞的实际生长速度调整接种量,使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度)
Day2:
(1)准备慢病毒颗粒:计算所需慢病毒颗粒的量,将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出,冰浴融化;
(2)感染目的细胞:从培养箱中拿出细胞,置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度;如细胞状态较好,则开始实验:
A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液,加入新的完全培养液;
B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液,将培养板平置于工作台上,以划 8 字的方式轻柔混匀;
C. 混匀后,细胞培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱,过夜培养。
Day3:
更换培养液:感染 12-16 小时后,吸出含慢病毒颗粒的培养液,重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS(胎
牛血清)的培养液,继续培养。(目的细胞需要调整感染时长,部分细胞不可感染超过 12 小时。)
Day4:
继续培养细胞,观察细胞状态是否有异常。
Day5:
观察(评估)慢病毒颗粒感染效率:盖紧 24 孔培养板,使用 70% 乙醇清理培养板外壁,在倒置荧光显微镜观察荧光,拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。(如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长,荧光表达所需时间也较长,建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。)
根据荧光情况,可以初步从 MOI 梯度摸索实验中,找出*适合目的细胞的 MOI 值。
原创作者:上海远慕生物科技有限公司