技术文献
一、细胞:
1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,*后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的*明显)。
4.培养时间。200 ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68 h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48 h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7.实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。
二、实验步骤:
贴壁细胞:
1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
2.5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100 ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况,3.5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20 ulMTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
5.终止培养,小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
三、悬浮细胞:
1)收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40 ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10 ul用培养液稀释1 ug/ml,需预试寻找*佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50 ul(即5×104cell/孔),共100 ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100(储存液100 1640)。
2)置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
3)每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570 nm(630 nm校准)测量各孔的吸光值)
4)离心(1000转x10 min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm(630 nm校准)测量各孔的吸光值。
四、MTT的配制:
MTT一般现用现配,过滤后4oC避光保存两周内有效,或配制成5 mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性,用的时候小心,有条件带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。
五、关于细胞的接种(铺板):
细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的(进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10 000/ml左右时,所测得的OD值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系,结果*可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快营养会不够,*后导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10 000/ml,100 ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区别更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104。
其它的声音:
1.首先细胞的接种密度一定不能过大,一般每孔1 000个左右就够了,我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10 000/孔是太高了,这样即使药物有作用,MTT方法也是表现不出的,*佳点板浓度在4 000-5 000/孔,太少的话SD值会很大。
2.MTT本身就是比较粗的实验,增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手,20%的波动也是常见的,所以很可能是技术原因引起的,特别是种板技术一定要过关。
3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100 000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40 000~80 000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60 000~70 000/ML的浓度组的.用40 000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时。
注意细胞悬液一定要混匀,已避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练,尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多,但是如果操作不熟,CV会在8%左右。另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
首先说说我的一点经验:
1.吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的3到4倍,可能比较容易混匀。10 ml的离心管里面装3~4 ml的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。
2.吸管的吸液量在1 ml左右:吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量1 ml多的吸管,总液量在5ml左右为益。
3.吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。
4.吹打次数100左右,就可以吹打均匀了(有人认为加细胞前吹打30-50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次,每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟,然后再以一定的速度吸取悬液。)
5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中央,而周边很少,这种不均匀的分散会产生接触抑制,影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中,向左3下,向右3下,在往返回复3下移动,目的是使得细胞能分散的均匀些。(铺板技术是MTT实验的关键,也是基础,一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞,*后细胞全死了,建议不要采用这种方法混匀细胞。
六、加入MTT:
个人认为MTT*关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例,具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定,我认为MTT多加一些比少加好一些。
MTT的量各家报道不同,一般是过量的,所以10 ul即够了。如果不使用96孔板,培养基超过100 ul,MTT按照10%的比例加入,加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀,不过这个应该关系不大。
如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜,且在加MTT前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的。
因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应,所以可以单独将药物和MTT加在一起,看会不会起反应。如果不起反应,就不用去除含药物的培液,直接加MTT即可。
七、如何清除上清:
百家争鸣:
1.加DMSO前要把液体吸掉,但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板,2 000 r,5分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500 rpm×10 min,且其做MTT用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160 ul即可)。
2.我每次将MTT加入后,再孵育四个小时,然后用离心机离心1 000G,5 min。但是用枪小心地吸上清,还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧!
3.另外,可以直接将板翻转倒扣(垫几层滤纸)2-3次,比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍,或者倾斜一点帮助吸液,发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱,但前提是你本身细胞贴壁要比较牢,半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话,阴性对照组可能由于细胞过多而使加入MTT后形成的结晶漂起来,这样就不能直接倒掉上清。
4.做MTT时,这一步骤一定要小心,不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉,从而影响OD值。悬浮细胞,不要翻板,离心后也不要翻板,这个方法害死人。
5.加完MTT反应3-4 h后,从培养箱取出96孔板的动作要轻柔,避免振荡结晶,使其滑落.你可以试着将96孔板倾斜30度角,然后用枪尖慢慢吸,有的细胞可以用排枪一起吸,有的则要耐心的一个个用枪头吸,枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底,且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平,这样也会使结晶脱落。
八、避免清除上清而改进的方法:
由于一般可离心96孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做MTT时,用DMSO溶解得到结果也不好,不是得不到预期结果就是可重复性差。
解决方法1:
用以下文献方法:周建军等,评价抗癌物质活性的改良MTT方法,中国医药工业杂志,1993,24(10):455-457
具体方法:
配三联溶解液:10%SDS,5%异丁醇,0.012 mol/LHCL,蒸馏水溶解。
操作:在培养板上加一定密度的细胞悬液,90 ul/孔;如需给药,则再于同时(悬浮细胞)或4h后(贴壁细胞)加入不同浓度的药物10ul/孔,均设三复孔。另外,每块板上另没一个调零孔(只加培养液,不含细胞和药物)。培养2 d后,加入MTT溶液20 ul/孔,继续培养4h,然后加入上述三联液100 ul/孔,于37度放置过夜后,用酶标仪测各孔A570值。
优点:简化操作,提高了可靠性。
解决方法2:日本同仁有一种新试剂CCK-8试剂, CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST–8[其化学名称为:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐],它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 染料(Formazan dye)。
生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分,无需再用缓冲液或培养基进行稀释;同时,CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此,无需特别的技巧,就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。
就是比较贵,如果经费充足,用这个是不错的。
4、在450 nm波长处测定吸光度,参比波长为600 nm或600 nm以上。
九、加入DMSO:
在同一批实验中不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净,没有去掉上清直接加DMSO,一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能被测到,会对*后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉,因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差,所以要在保证细胞不被吸掉的前提下,尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净,空白孔也要留有等量的培养液,这样在检测时可以尽量去除培养液的影响,DMSO的量也可为100ul或150ul。
1.加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5-10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信。
2.加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶,溶解后尽快检测。如果实验孔不多,建议用此法,因其比振荡溶解效果好。
3.或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。
十、OD值的测定:
至于测定波长的选择是因显色溶液而异的,对于DMSO,溶解后呈紫(红)色,490 nm有吸收值,而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO,它的测定波长是570。(就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492,选用TMB显色液则用450);而对于SDS和酸化异丙醇,则选用570 nm,并且建议以655nm作为参考波长。
DMSO溶后10分钟内测,越放颜色越深,而SDS做为溶解液测吸收光值,其值可在三天内保持不变。
细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大,细胞密度小吸光度也会偏小;另外跟细胞状态也有关系,细胞状态不好的话,吸光度值也会低的;细胞数目少,或者是培养的时间短,OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高,很可能是细菌污染。
复孔直接的OD值差别一般应在0.1-0.15,差别太大考虑:1.接种细胞数不均匀,或是接种太多,应保证每孔一致,一般是每孔1 000-10 000个。可以细胞细胞计数后,加入细胞悬液,再补培养基到预定体积,并轻轻吹打几次,使细胞均匀分布,这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好,接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间:18-24 h,如果不够,未悬浮的细胞会被吸掉。
一般为了实验的准确,每个浓度可以设5-6个复孔,可以*后统计时,可以除去一个值和一个值,或者除去其中数据离谱的值,这些离谱数字的出现与细胞是否污染,细胞是否在培养期间死去,是否培养液蒸发过多,加MTT液是否准确,在37℃,5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定(1-4小时)等有密切的关系,当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要!(一般开机预热20 min)。
MTT方法的吸收度在0.2~0.8之间误差较小。这和分析化学中的lambert-beer定律有关, 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中,经常出现标准曲线不呈直线的情况,特别是当吸光物质浓度较高时,明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量,将会引起较大的误差。在吸光光度分析中,仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定,实验条件偶然变动,读数不准确等。
在光度计中,透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器,读数的波动对透射比为一定值;而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大,读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时,浓度测量误差都较大,即光度测量选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间,或使吸光度A在0.2~0.8之间,才能保证测量的相对误差较小。当0.434(或透射比T=36.8%)时,测量的相对误差*小。
其它的声音:
1.用570 nm波长的滤光片,因为MTT在这个波长的吸光度是峰值,换句话说灵敏度高。用其它波长的也有,一般是490 nm,但我的经验灵敏度降低一半。
2.我们用的BIO-TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果复孔之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差,我曾经看到园子的有些帖子报道说OD值大概在0.2-1.2范围内与活细胞数有较好的线性关系,但OD值在0.3-0.9范围内可能更佳,若你的OD值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适,应调整你的细胞数。
边缘效应
十一、关于如何计算IC50:
Pn:*小阳性反应率
举个例子:各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。
代入计算公式:
十二、结果统计学处理:
所有数值以x±s表示,应用SPSS软件进行方差分析,p<0.05时为相差显著,p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线,专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组
excel表中可以做两两比较的T-test,这个你可以参考一下;你的数据应该用多个样本均数的T-test,方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。
强烈建议培养板不要重复使用:1、泡酸是可以,但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长,会出现帖壁不好,细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底,如果有万一,则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质。
洗净后用2% NaoH浸泡4小时,再用1%稀盐酸浸泡4小时,冲洗15遍,蒸馏水冲洗3遍,烘干,UV照射过夜(紫外2小时以上消毒即可)
泡酸2-4小时,老师让我们别超过4小时,(普通的玻璃仪器是过夜)。捞出,冲洗干净,烘干后,UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起,钴60照射消毒.
1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净,然后用洗衣粉水泡几个小时(小心让洗衣粉先化开)。2.用自来水冲净洗衣粉水,倒扣晾干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液(六小时以上即可)后自来水洗净(20次左右)每个孔都要处理。4.用去离子水冲洗3遍,双蒸水冲洗3遍,烤干。5.超净台中紫外线照射2个小时左右,就可以用了,不可以高压。
5、做实验前,96孔板至少在紫外灯下照射30分钟,但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄,我的两块板放在超静台上忘了拿出来,一直照了两个星期,等我从超静台上取出板已经变成黄色。
原创作者:上海远慕生物科技有限公司
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