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蛋白分离纯化方法之免疫亲和层析法
阅读次数:183 发布时间:2023/3/17 11:10:21
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亲和层析法是重组蛋白纯化的重要方法,被广泛应用蛋白质的研究域,是分离纯化和分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。免疫亲和层析是亲和层析方法的一种,该方法利用抗体与其相应抗原的作用具有高度的特异性和高度结合力的特点,用适当的方法将抗原或抗体结合到层析载体上,便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。

目在重组蛋白纯化中已经使用单克隆抗体作为亲和配体的亲和层析方法,利用抗体-抗原模式,有可能得到每一种目标蛋白的单抗,然后以单抗为配基,通过亲和层析技术分离纯化重组蛋白。该种方法的纯化配属和活性回收率较高。通过研究发现,抗体与蛋白A或蛋白G微珠共价交联后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性,且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱,已成为一种实用和有效的重组蛋白纯化方法。
重组蛋白技术在蛋白质结晶、蛋白质药物、蛋白质相互作用及结构蛋白质组学研究中具有非常重要的作用。远慕生物在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富,拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)和哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

1、小鼠腹水中JWA单克隆抗体制备的研究

JWA是一种新的微管结合蛋白,不仅参与全反式维甲酸(ATRA)诱导的细胞分化调节,而且与多种细胞分化、凋亡诱导剂的生物学作用有关,涉及相应的信号通路。JWA可以调节白血病细胞的分化,还可以通过丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路调节肿瘤,如宫颈癌、乳腺癌和肝癌等细胞的迁移。JWA还活跃地参与细胞对应激刺激,如冷应激、热应激和化学物诱导的氧化应激等的应答。

有研究者建立小鼠腹水中JWA单克隆抗体(Monoclonalantibody,mAb)的制备方法及鉴定,获得高纯度、高/效价的JWA单克隆抗体。先对预先用弗氏不完/全佐剂处理的小鼠腹腔接种JWA单克隆抗体杂交瘤细胞,收集小鼠腹水、离心,采用ProtienG亲和柱层析法进行亲和层析纯化JWA单克隆抗体,并采用SDS-PAGE检测方法分析纯化抗体的纯度。分别运用细胞免疫荧光、免疫印迹技术鉴定纯化的抗体特异性。BCA法测定纯化后JWA单抗的浓度为6.79mg/mL;SDS-PAGE电泳显示纯化的抗体只有IgG的重链和轻链,而没有其它杂蛋白带;纯化后的JWA单抗在免疫荧光实验可以检测到细胞中JWA蛋白在胞浆中呈丝状均匀分布,与期实验结果一致。

免疫印迹实验中1∶800、1∶400均可以得到清晰的目的条带。用ProteinG亲和层析法获得了高纯度和较高/效价的JWA单克隆抗体,这将为JWA蛋白的基础和应用研究提供技术支持。

2、免疫亲和层析方法的特点

免疫亲和层析作为一种重组蛋白纯化方法,也是一种既简单又非常有效的分离抗原的技术。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上,然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后,通过洗涤去除无关的抗原,然后用洗脱缓冲液处理微珠,结合的抗原被洗脱,从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件掌握较好而且比较温和,纯化的抗原仍能保持其天然状态。虽然下述的所有实例都是以蛋白质抗原作为研究对象,但凡是能与抗体有效结合的分子都能用这种方法进行纯化。

免疫亲合层析具有以下特点:

(1)抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性,能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原;

(2)不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析,但一旦获得一种性能良好的抗体,纯化过程就简单、快速、可靠;

(3)可按照不同规模进行,半天内即可完成,而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果;

(4)经过简单的改进,免疫亲和层析法也可用于纯化针对抗原的特异性抗体。

影响免疫亲和层析纯化的因素主要有3个:先是抗原或抗体的初浓度,其次是两者之间的亲和力,再次是抗原抗体是否容易解离。有研究者利用吸附层析结合免疫亲和层析的方法分离纯化得到一种蛋白复合体,该复合体含有调节转录的辅阻遏物蛋白SMRT和N-CoR。还有研究者利用免疫亲和层析从病人的血清中纯化出抗神经酰胺单己糖(CMH)的特异性抗体。

为了发现和生产治疗疾病的蛋白,人们有必要进行重组蛋白纯化。传统的纯化规程正被高度选择性和成熟的以亲和层析为基础的策略所代替,亲和层析可能是现行仅有的着重于高通量和扩大规模蛋白质组学关键问题的分离技术,主要的问题是设计新的技术来确定与假设目标相结合的高选择性的亲和配体。利用理性和组合的方法设计具高选择性和稳定性的配体对于亲和层析未来的应用会有巨大的影响。

原创作者:上海远慕生物科技有限公司

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