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在质谱分析前,样品制备须注意这六方面 远慕新闻√
阅读次数:84 发布时间:2019/9/23 9:34:15
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2014年,人类蛋白质组草图绘制完成,这是继人类基因组计划之后第二个生命科学的里程碑,为人们深入了解疾病状态下的机体变化奠定了基础。中国人类蛋白质组计划近两年也陆续公布了*阶段的成果,有望揭示肿瘤的分子机制和治疗靶点,推动了精准医疗的新浪潮。

质谱(Mass Spectrometry, MS)已成为蛋白质检测和鉴定的首选方法。质谱仪的准确性、灵敏度和灵活性实现了生物研究、生物制药和诊断检测方面的新应用。不过,由于蛋白质组非常复杂,制备质谱分析所用的蛋白质样品尚无标准方法。那么,在样品处理时需要注意什么呢?

明确样品类型

针对不同类型的样品,比如细胞、组织、体液(包括血清、血浆、尿液和脑脊液等),前处理方法是不同的。在设计具体的样品制备策略时,我们应当考虑多个因素,包括样品类型、蛋白质的各种性质以及它在细胞中的定位。针对这些因素进行优化,才能产生灵敏而可靠的结果。

需要注意的是,蛋白质往往以不同的量存在,而高丰度蛋白会掩盖低丰度蛋白的信号。血液样品中就含有大量干扰的高丰度蛋白(比如血清白蛋白和免疫球蛋白),影响了生物标志物的检测。

传统切胶去除法操作麻烦、效率极低且重复性很差,逐渐被淘汰。利用色谱柱和液相去除的方法虽然效果还可以,但时间冗长,很难实现多个样品同时操作。近年来基于离心柱形式的高丰度蛋白去除试剂盒越来越受欢迎。远慕生物也提供了以下三种产品。

样品处理方法

质谱分析前的样品处理是一个复杂的过程。在富集目标蛋白或研究蛋白定位时,可能需要先进行亚细胞蛋白组分分离。之后可采用基于蛋白序列、抗体表位、翻译后修饰(PTM)或活性位点结合等多种不同的技术对蛋白质进行富集。这是分离低丰度蛋白或降低样品复杂度的必经步骤。

之后还要进行变性、还原、烷基化、除盐、纯化、再除盐等一系列冗长的步骤,不过目前市场上也有商品化的快速处理试剂盒,能够将处理时间从2天*快缩短到3小时。比如,远慕生物的EasyPep Mini MS样品制备试剂盒利用预先配制的缓冲液、质谱级的酶混合物以及多肽纯化柱来处理哺乳动物细胞和组织,不到3小时就可以生成与质谱兼容的多肽样品。


图1. 传统方法与优化试剂盒的对比

多肽定量

正如western blot电泳之前对蛋白裂解液进行定量一样,质谱上机前也必须对酶解后的多肽进行定量,以便优化蛋白样品/蛋白酶的比例。此外,串联质谱标记(TMT)的上游也建议要测定蛋白/肽段的浓度,以确保在混合之前用于标记的样品是完全等量的。

由于大多数的蛋白定量方法在检测酶解后的肽浓度时不够灵敏,推荐使用易用型的Pierce比色法或荧光法肽段定量试剂盒进行肽段浓度测定,这两款试剂盒是专为提高肽段混合物定量的灵敏度和重复性而设计的。显色法肽段定量试剂盒 可以兼容后续的TMT定量。荧光法肽段定量试剂盒 一般不能兼容后续的TMT定量。

多肽标记

根据样品类型和是否需要标记,一般有如下几种标记选择。串联质谱标记(TMT)和代谢氨基酸标记(SILAC)可以实现多个样品的质谱分析,增加样品通量,对来自细胞、组织或体液的2-10个不同样品进行相对定量。TMT因为其能实现多至11标的高通量,且定量稳定,所以成为目前市面上*常用的定量蛋白组学方法。


 

多肽富集和组分分离

低丰度蛋白的成功分析和磷酸化肽段的鉴定往往离不开这几步:富集、分离和/或纯化。在细胞裂解液中,许多磷酸化肽段以极低的水平存在。您可以根据研究方向选择富集方式,如果要富集磷酸化肽段,基于Fe-NTA 和 TiO2的方法是主流,一般用富集率和鉴定率来衡量质量。

研究人员曾用远慕High-Select™ Fe-NTA磷酸化肽段富集试剂盒对3份293T 细胞裂解液进行重复试验,三次重复的磷酸化肽段富集效率均在高达97%以上,且共鉴定出10,898条多肽信息,鉴定率均在50%以上。

由于每种配体的结合性质不同,如果将Fe-NTA 和 TiO2的方法连用,可以实现磷酸化多肽的*富集效率和覆盖度。

对于组分分离,除了传统的液相系统外,您还可以采用离心柱形式的高pH反相多肽离心柱。Pierce高pH反相多肽分离试剂盒包含高pH值的溶液(0.1%三乙胺)和12支离心柱,结合离心机使用只需1小时即可完成分离,且可以同时实现多个样品的高通量操作。

多肽脱盐纯化

上机前的*后一步就是要保证多肽经过脱盐纯化,脱盐不充分不仅会影响目的肽段的鉴定,而且容易损坏仪器。此时可使用反相(RP)树脂来去除盐和缓冲液,其中C18基质是用于捕获疏水肽的理想基质。多肽在高水相流动相中与反相柱结合,同时盐和缓冲液被洗去,然后用高有机相流动相洗脱多肽。Pierce™ C18系列不仅提供了适合大体积样本的离心柱(column),还提供了适合小体积样本的吸头(tip)。

总而言之,质谱上机前的样品制备流程环环相扣,每一步若质量不达标都会影响整体检测结果。为了帮助科研工作者从复杂的流程中解放出来,远慕致力于研发和拓展质谱兼容的产品和技术,为蛋白质组学研究提供整体解决方案。

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