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使用慢病毒的常见问题 远慕新闻√
阅读次数:36 发布时间:2019/9/29 9:56:19
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1. 怎样购买份量合适数量的慢病毒颗粒?

一套完整实验所需的慢病毒颗粒包括:1. 含有目的基因的慢病毒颗粒,2. 阴性对照慢病毒颗粒,3. 用于预实验的阳性对照慢病毒颗粒。

购买时可以根据目的细胞特性、检测方法、培养器皿估算慢病毒颗粒的*佳用量,避免剩余的大量慢病毒颗粒超出*佳保存期;此外,GeneCopoeiaTM 同时提供高滴度低价格的阳性对照慢病毒颗粒,帮助您以较低的预算和较充足的材料完成预实验的条件探索。初次使用慢病毒颗粒的研究者也可使用阳性对照慢病毒颗粒熟悉实验过程。

2. 慢病毒颗粒可以用于动物体内(In vivo)实验吗?

GeneCopoeiaTM 提供的即用型慢病毒颗粒全部经过纯化、浓缩处理,去除了细胞碎片等杂质,进一步降低免疫原性,适用于各类活体动物注射实验和成瘤实验。

3. 慢病毒颗粒对目的细胞的感染效率很低,如何提高感染效率?

提高感染效率的前提是保证细胞生长状态良好。其次,可以通过提高 MOI 值来提高感染效率,也可以在培养基中加入 Polybrene (4-10 µg/mL) 提高感染效率。

4. 添加慢病毒颗粒后,细胞为什么大量死亡?

慢病毒颗粒对靶细胞有一定毒性。添加量过多、感染时间过长都可能对目的细胞 造成伤害。如遇上这种情况,建议您降低 MOI 值,并在感染细胞 4-8 小时后进行换 液(以新鲜的全培养基替换含慢病毒颗粒的旧培养基),*长换液时间不可大于 12 小时。

5.Polybrene 是什么?在慢病毒颗粒感染中,Polybrene 添加越多越好吗?

Polybrene 是常用的感染添加剂,通常的使用浓度为 4-10 µg/mL,Polybrene 能 显著提高慢病毒的感染效率,通常能提高感染效率 2-10 倍,对部分细胞甚至可 提高感染效率 10-20 倍。当目的细胞 MOI 高于 20 时,我们建议在培养基中加入 Ploybrene(约 4-10 µg/mL) 适当提高感染效率。

然而,Polybrene 有一定的细胞毒性,不同细胞对 Polybrene 的敏感度和耐受性不同,部分细胞对 Polybrene 反应明显,容易导致细胞状态变差、形态发生变化、甚至死亡,因此并非每种细胞都适合添加 Polybrene。

在正式使用 Polybrene 前,建议在 1-10 µg/mL 范围内设置梯度,观察细胞在该浓度下,24 小时后是否仍保持健康生长,从而确定该细胞的*适 Polybrene 浓度。

6. 目的细胞可以被慢病毒颗粒感染,但 eGFP 的荧光强度很低,为什么?

在目的细胞被慢病毒颗粒感染过程中,eGFP 荧光强度取决于病毒感染细胞内的慢病毒颗粒数、细胞本身的状态、细胞类型以及观察时间等。一般情况下,目的细胞感染慢病毒颗粒数越多,细胞增殖越快,eGFP 荧光会较强。慢病毒携带基因表达时间较长,一般在增殖较快的细胞中也需要感染 72-96 小时才会到达 eGFP 的表达高峰。对于增殖较慢的细胞,感染时间则需更长。建议如果您的细胞在感染后观察的荧光强度较低,建议继续培养一段时间再观察。

7. 进行慢病毒颗粒感染后,为什么目的细胞用 qPCR 检测不到目的基因表达量的变化?

如果使用的检测方法是 qPCR,原因可能是目的基因含特殊序列结构、或与目的细胞系统不能兼容的问题,导致转录受影响,建议同时培养、感染目的细胞和 293T 工具细胞,同时进行检测,如目的基因在 293T 细胞转录不受影响,则可能为目的基因与目的细胞的相互作用导致转录受阻。

8. 慢病毒颗粒在储存期间不慎染菌,还可以继续使用吗?

如慢病毒颗粒不慎染菌,且实验材料有限,可以使用 0.45 µm 滤膜对慢病毒进行滤菌操作。当然,该操作会导致一定程度的滴度损失及慢病毒颗粒总量损失。如条件允许,建议重新购买该种慢病毒。

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