荧光素标记

荧光色素是常用于标记抗体的标记物。荧光素经恰当的激发可发光，从而得知抗体的定位和待测抗原的分布情况，主要用于细胞分选或高分辨率免疫染色，是一种非常好的亚细胞水平精/确定位的方法。

酶标记

酶标记抗体是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成，其应用范围非常广泛，结果即时可见、敏感性高，但较难应用于定量分析。

生物素标记

生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，将生物素与抗体共价结合是一种非常简便、直接的标记方法。

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）简介

1941年，Coons等于/次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完/全解/决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

一、荧光免疫技术的概念：

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展早的一种。将抗原或抗体用荧光素进行标记，标记的抗原或标记的抗体与相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术称为免疫荧光素技术。免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。

二、荧光免疫技术分类：

（1）荧光抗体显微镜技术：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。

（2）免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法

三、荧光的产生：

物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素。由光激发所引起的荧光，为光致荧光；由化学反应所引起的荧光，为化学荧光。

四、荧光素的荧光特性：

（1）停止供能，荧光现象随即终止

（2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长<发射光波长

（3）荧光效率：荧光效率=发射荧光的光量子数 /吸收光的光量子数

（4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱

五、常见荧光素：

（1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，/大吸收光波长为490～495nm，/大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目应用广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

（2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长/期保存。/大吸收光波长为 570nm，/大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。

（3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。/大吸收光波长为 550nm，/大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。

（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，适合用于分辨荧光免疫测定。

（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，/大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。

（6）多甲藻叶绿素蛋白 （peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，/大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。

（7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。 FL2探测器检测PI。

常见荧光素的特性：

（1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。

（2）RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。

（3）TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。

（4）镧系：Eu、Tb

（5）PE：吸收光490～560nm，发射光595nm，红色荧光。

（6）其它：酶作用后产生荧光物质。

六、合适荧光素的选择：

（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。

（2）荧光效率高，标记后下降不明显。

（3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。

（4）标记后能保持生物学活性和免疫活性。

（5）标记方法简单、快速。

（6）安全无毒 。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司