ELISA实验显性淡、灵敏度低怎么回事?_技术文章

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ELISA实验显性淡、灵敏度低怎么回事?
阅读次数：546 发布时间：2020/6/2 14:47:50

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问题	序号	可能原因	解决方法
显色淡，灵敏度偏低	1	试剂盒未充分平衡	试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）
	2	样品不适合做ELISA检测	样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）
	3	酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥	防止板过于干燥
	4	包被抗体遭到破坏	操作温和，移液枪不能碰到孔底
	5	样本和抗体孵育条件不合适	按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。
	6	洗涤浸泡时间过长	按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间；
	7	偶联HRP试剂污染	弃去试剂，重新配置
	8	错误的稀释偶联HRP试剂	弃去试剂，重新配置
	9	TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间	确定合适的孵育时间：人为判定-浓度的标准品出现深蓝色；S4-5有淡蓝色；机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65
	10	样本浓度过高或存在基质效应	建议做不同稀释倍数，确认样本*佳稀释倍数。
	11	酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对	确认仪器设置及选择正确的波长检测。
	12	酶标板不适合做ELISA	不能使用细胞培养板，建议使用ELISA专用高吸附力板子。
背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2）	1	洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留	洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。
	2	底物污染，未避光保存，出现颜色	弃去底物，重新配置
	3	样品稀释液污染	弃去稀释液，重新配置
	4	吸头重复使用，未洗净或消毒不彻底	吸头尽可能一次性使用
	5	不正确的孵育时间，温度（尤其是底物孵育的时间）	*为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。完全按照说明书要求。
	6	偶联抗体（streptavidin-HRP）浓度过高	按照说明书调整到*佳的浓度
	7	ELISA板子不正确的贮存	酶标板贮存于2-8 ℃；使用结合力低点的Elisa板
	8	没有正确封闭	在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间
	9	样本溶血严重	建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。
重复性不佳，高CV值	1	样品不均一	加样前充分混匀样品，取样确保移液位置一致；
	2	包被板表面遭到破坏	洗板加样时尽量小心，避免破坏板的包被表面
	3	孔与孔之间的交叉污染	孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染；封板膜不能重复使用
	4	加样量不一致	样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴
	5	边缘效应（外周孔显色较中心孔深）	孵育时尽量100 rpm旋转混匀
	6	微量加样不准确	保证微量加样的准确性和均一性
	7	不正确的洗涤	洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，确定每一步的洗涤
出现白板，阳性对照不显色	1	显色液变质	更换新的显色液
	2	洗涤液配制有误	请按说明书所示稀释倍数配制
	3	未加酶结合物而认为已加入	注意不要漏加
	4	终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用	每次加液前均应看清标签
	5	标准品稀释方法错误/或标准品有问题	请按照说明书所示配置说明书，注意单位和稀释倍数
	6	不同试剂盒或不同批号的试剂混用	建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。
不正常的标准曲线	1	错误的方法重悬标准品	加入正确量的溶液重悬标准品，重悬充分
	2	标准品稀释错误	按照说明书要求稀释标准品
	3	标准品污染	使用一次性的灭菌吸头，标准品贮存于2-8 ℃
	4	错误的倍比稀释步骤	按照说明书倍比稀释标准品
	5	波长选择错误	TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。
	6	标准品混用	不同批号试剂勿混用
	7	试剂盒在运输途中时间太长，温度太高，标准品失活	尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温
	8	ELISA未终止而直接检测450nm和620nm	TMB显色需终止后检测，否则会出现620nm比450nm读数高的现象。（数值仍有梯度规律）
样品或标准品OD超出正常范围	1	错误的样品或标准品的稀释	完全按照说明书稀释
	2	偶联抗体浓度过高	按照说明书调整到*佳的浓度
	3	TMB底物孵育时间过长	调整到合适的孵育时间
	4	样品或标准品污染	避免污染
	5	错误的孵育时间或温度	完全按照说明书
	6	孵育时未加盖导致溶液挥发和污染	贴封片或加盖
标曲很好，但是样本无法计算到数值	1	标曲选择不合适	选择*合适的标曲拟合；
	2	样本含量很低，低于灵敏度无法被检测到	尝试浓缩样本或使用高敏elisa试剂盒检测
	3	样本含量很高，超过标曲	建议进行预实验摸索稀释倍数，确保样本OD值落在标曲范围内
标曲高浓度间无明显趋势	1	如OD绝对值靠谱，但是仅无梯度，则显色过度	TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。
标曲高浓度间无明显趋势	2	仅作单波长检测。	由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等，对结果也有影响。建议终结果以双波长为准确。