胞嘧啶碱基编辑器（CBE）由胞嘧啶脱氨酶和nCas9蛋白融合组成。其中，经典的胞嘧啶碱基编辑器BE4max CBE是由鼠源脱氨酶APOBEC1、nCas9蛋白和两个尿嘧啶糖基化酶抑制剂构成。该项研究基于结构生物学改造了一类人源脱氨酶A3G, 并用其替代BE4max CBE中的鼠源脱氨酶，使A3G-CBE能够-程度地只编辑靶向碱基C而不影响与其紧邻无关的C。

单碱基编辑面临精度挑战

与传统基因编辑策略相比，基于CRISPR/Cas9系统的DNA单碱基编辑技术不会产生DNA双链断裂, 因此避免了由易错DNA修复通路所引入的随机序列插入和删除（Indels），从而极大地提高了编辑效率和产物纯度，为基因编辑应用在遗传疾病的基础研究和治疗带来了曙光。

胞嘧啶碱基编辑器能够在靶基因座上高效地进行胞嘧啶到胸腺嘧啶（C-to-T）的转换，并已经被用于相关疾病动物模型治疗研究，例如纠正由地中海贫血症。



“但是，单碱基编辑仍然面临精度挑战。”举例说，当靶向碱基C紧邻的碱基也是C时, 目前的CBE碱基编辑器很难区分它们。因为两个相邻的碱基C往往都会被编辑，从而无法达到精准纠正相关疾病的目的。这为使用CBE编辑器研究和治疗此类遗传疾病带来了很大困难。

改造脱氨酶

之前研究表明，野生型的人源脱氨酶A3G主要对DNA单链5′-CCC-3′基因组序列中的第三个C产生脱氨基作用，即由C编辑为T。因此，这种选择性有很大潜力被用于连续C区域的精确碱基编辑。

他们首先通过密码子优化，将野生型的A3G用于替换BE4 max中的鼠源脱氨酶rAPOBEC1，构建出A3G-BE 2.1。

因为A3G 的N-端结构域会导致A3G单体的聚集，并阻止A3G的脱氨活性；而A3G的C端结构域本身足以脱氨。为了提高编辑效率，他们进一步构建了只保留C端结构域的A3G-BE 4.4。

在细胞中的测试结果显示，A3G-BE 2.1和A3G-BE 4.4均可有效地区分连续C区域中的靶向C和无关C，而BE4 max则无选择性地将两个连续的C全部编辑。

为了进一步提高A3G-BE的编辑效率，他们通过分析A3G的C端结构域中的关键氨基酸，设计了三组突变，分别用于加强脱氨催化活性，增加ssDNA结合亲和性，提高蛋白质溶解度。

而为了保留A3G的高选择性，研究者同时又引入Y315F来提升非特异性DNA结合，从而*终优化得到了A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14。其中，A3G-BE5.13的碱基编辑活性稍高，A3G-BE5.14的选择性稍高。“两种新CBE可以在不同情形的多C编辑中互补。

准确性安全性俱佳

为了验证改造后的A3G-BE，他们将A3G-BE 4.4、A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14用于在细胞系中构建疾病模型和校正单碱基突变疾病，并与BE4max相比较。

结果显示，改造后三种A3G-CBE能够选择性地对5′-CC-3′序列中第二个C而非个C进行编辑，明显区分了靶向C和无关C，并生成了高占比的目标基因型，而BE4max则无法产生理想的靶向C编辑结果。

值得注意的是，A3G-BE5.14在生成转甲状腺素模型淀粉样变的疾病模型的效率比BE4max 高613倍，更突出了其精确性的优势。

而在疾病模型的测试中，A3G-BE4.4以大于50%的靶向C编辑效率高效校正了导致全羧化酶合成酶缺乏症的单碱基突变，并且没有对邻近无关的C产生编辑。其产生理想校正基因型的能力比BE4max高6496倍。

“与BE4max CBE相比，A3G-CBE在纠正相关单碱基突变疾病的能力提高得非常显著。”

为了研究A3G-CBE的安全性，他们还通过RNA测序和全基因组测序进行脱靶编辑的表征。结果显示，靶向编辑活性较高的A3G-BE 5.13与对照nCas9的脱靶水平相当，没有显著脱靶效应。

这些结果进一步证明，A3G-CBEs具有很高的应用价值，有很大希望被用于单碱基突变遗传疾病的体内治疗研究。这项研究进一步加快了精准碱基编辑迈向临床应用的步伐。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司