细胞培养是一项艰难的工作。因为这是一个高度技术性的过程，当你从一个来源提取细胞并在另一个条件下去对他们进行操作时，可能会出现很多问题，比如受到外界的污染，或者生长速度非常缓慢。

但其中也有许多是我们可以去控制的。在过去的100多年里，贴壁细胞培养实验为现代医学的一些/具革命性的进/步做出了贡献，促进了我们对癌症等疾病的理解，并支撑了安全有效的治疗方法的发展。

幸/运的是，现在人们对细胞培养的了解比20世纪初体外培养先驱罗斯·哈里森（Ross Harrison）在玻片上分析青蛙组织时多得多。下面跟着远慕一起来看看培育活细胞的基本知识，包括如何接种、增殖和收获。低温状态下的细胞接种

在购买细胞培养品系时，产品是冷冻保存的，这对长/期保持细胞活力是必要的。在这种状态下，你需要解冻并进行细胞接种，这个过程应当是非常谨慎小心的，即便它发生得很快。然而，这一重要的步骤的经常匆忙进行，有时很多细节甚至被忽视，这就存在了细胞被污染的风险，也没有给细胞提供它们所需要的良好的、无菌的开始。

以下是进行细胞接种的正确方法：

准备好所需的所有的器具。你需要一个冷冻的小瓶子、一个烧杯或水浴槽，装满预热的水，和一个装有预平衡介质的烧瓶。如果你打算降低细胞的活跃度并去除DMSO或其他低温保护剂，你还需要一个锥形瓶用于盛装这些介质。

加热小瓶子。在装有预热过的水的烧杯中轻轻搅动冷冻的小瓶子，直到里面的组分几乎完/全融化。然后，用酒精湿巾清洁小瓶，以减少被污染的风险。

接种细胞。使用移液管，从冷冻液中取出细胞并转移到烧瓶中。然后用移液器反复吸取混匀溶液，以便接种。这样，你的细胞就会被解冻、转移、并准备好进入培养箱（或用于去除DMSO的离心机）。

细胞数量随着细胞增殖而扩大

当细胞生长到一定密度后，需要对细胞进行分离传代。你需要掌握正确的细胞分离方法。细胞增殖是细胞培养的必要部分，依赖于效率和一致性。如果使用的工作流程效率低下，可能会提高供应和人工成本；如果遵循了后不一致的工作流程，则可能会给您的细胞带来过度压力，并杀死它们。

达到目的的方式取决于你的对于实验容器的选择。市面上有非常多的选择，比如使用i-Quip?容器，可以帮助生命科学家在更小的空间中建立友好的环境，以实现更快的生长，也更多的减少劳动力和污染风险。

因为不是所有的容器都具有相同的生长面积，研究人员通常会考虑细胞/cm2的产量来决定他们的容器选择和相关试剂的用量。然后，他们将利用这一技术持续地进行细胞接种实验，使其达到研究人员所需的细胞数量。为了获得/佳生长/效果，通过以下操作保持细胞/cm2和mL/cm2的比例稳定来选择容器和试剂：

使用这个公式来计算您的细胞数量，以容器为单位：[(所需细胞/cm2)×(容器的面积cm2)]；

应用这个公式来计算每个容器所需的试剂量：[(期望mL数/ cm2)×(容器的面积cm2)]。为了达到/佳的细胞生长和气体扩散，大多数情况下每cm2的细胞生长面积将需要0.2 mL到0.5 mL的培养基。

收获你的贴壁细胞

当细胞在显微镜下呈现为单层时，你就知道它们已经准备好被收获了。实验员们一般会通过化学或物理手段分离细胞。

一种方法是通过解离试剂进行化学分离，需要针对细胞类型和应用进行优化，以确保细胞不受试剂的负面影响。相比之下，对于可能不耐受解离试剂的强黏附、敏感细胞，通过细胞刮除器进行物理清除可能是更好的方法。同时还需要考虑下游应用场景，以及如何或是否解离试剂可能影响您的研究。

如果您选择使用解离试剂，请使用移液管无菌地遵循以下操作步骤：

从培养瓶中取出培养基；

向培养瓶中加入PBS等缓冲溶液，以去除可能干扰解离剂的任何微量血清。轻轻摇动容器，使里面的溶液均匀。浸泡10到15分钟以分离哪些难以分离的细胞系。移去缓冲液；

以0.02到0.03 mL/cm2的比例添加解离试剂。根据细胞系或解离试剂的特性，在37℃孵育可以促进解离；

当细胞状态呈现圆形，但还没有开始聚集时，它们就已经准备好了——就好像你在看一个充满了成千上万颗星星的夜空。溶液开始变得浑浊是一个好迹象，表明它们已经准备好被分离了；

用缓冲液或含血清的培养基稀释解离试剂，通常以1:1的比例稀释。在去除整个溶液并将其转移到试管内之，上下吸取几次以混匀；

如果细胞对试剂特别敏感，则建议通过离心法实现细胞的分离。

现在你的细胞可以计数了，同时也可以对其细胞密度和活力进行测量了。

通过细胞培养达成你的研究

贴壁细胞培养可以为你的实验室打开一个实验和下游应用的全/新——它同样也可以很有趣。但当你操纵活体细胞时，可能会有很多风险，所以正确的操作非常重要。通过遵循这些基本的指示，并努力达成更完善的操作流程，你可以逐步成长为一个细胞培养家。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司