【实验目的】

（1）学会正确使用微生物实验中常用的接种工具，掌握各种接种技术。

（2）观察细菌的培养特征，学会判断细菌在不同培养基上的生长状况。

【实验原理】

1．无菌接种技术

无菌接种技术是微生物研究中基本的操作技术。所谓接种即把微生物纯菌种在无菌条件下移植到适宜的培养基上，经培养获得纯培养物。因此，接种一般要求在无菌室、超净工作台（图2-1）或实验室火焰旁严格按无菌操作进行。根据实验目的的不同，采用的接种方法也不同，一般可分为斜面接种、平板接种、液体接种、穿刺接种等。斜面接种：是从已生长好微生物的斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜空白斜面培养基上的接种方法。它是菌种培养的常用方法。平板接种：是用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后进行培养。它主要用于菌落形态观察、分离纯化菌种、活菌计数或其他试验。

穿刺接种：是主要用于接种厌氧菌、检查细菌的运动能力或保藏菌种的一种接种方法。接种时，将沾取菌种的接种针从半固体培养基表面向下穿刺，在接近管底处，接种针再循原路抽出。液体接种：是将斜面菌种或液体菌种接种到液体培养基中的一种方法。它用于菌种的液体培养或液体培养基中生长特征的观察。

2．细菌培养特征观察

培养特征是指微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。在一定的培养条件下，不同的微生物培养特征各不相同，这是鉴别各种微生物的依据。细菌培养特征一般用固体、半固体和液体培养基进行培养观察，其中固体培养基又分平板和斜面两种形式。斜面培养基上的菌苔特征：自下而上在斜面培养基上划一直线接种，经培养，不同的细菌可以呈现丝状、刺毛状、念珠状、疏松状、树枝状或假根状等不同的菌苔特征。平板培养基上的菌落特征：把细菌培养在平板上，主要观察菌落的形态、隆起及边缘等状况，例如菌落的大小，表面干湿程度，隆起、扁平或凹陷，粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明、半透明或不透明，颜色以及质地等，如图2-2所示。



液体培养基中的生长特征：细菌在液体培养基中有三种生长现象。大多数细菌在液体培养基中生长繁殖后呈均匀混浊；少数链状排列的细菌（如链球菌、炭疽芽孢杆菌）等则呈沉淀生长；枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。半固体培养基中的生长特征：半固体培养基主要用于细菌动力学试验。有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明。

【实验器材】

1．菌种大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Stap hyloccocus aureus）、蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）等。

2．培养基牛肉膏蛋白胨水培养基（斜面、液体、半固体）。

3．仪器和用具接种环、接种针、涂棒等接种工具（图2-3）。试管、移液管、滴管、培养皿、培养箱、酒精灯等。



【实验步骤】

1．斜面接种

1）贴标签：接种在距试管口2～3cm位置上贴上标签，注明菌名、接种日期等。

2）点燃酒精灯。

3）手持试管：将试管放于手掌中，并用手指夹住，使两支试管呈“V”字形。

4）接种环灭菌（图2-4）：用火焰将接种环烧红，然后将接种环来回通过火焰数次。



5）拔管塞：用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并夹于手中。试管口缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫。

6）取菌种：将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，再轻轻沾取少量菌体或孢子，然后将接种环移出菌种管。注意：不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使接种环通过火焰。

7）接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接种斜面试管。从斜面培养基的底部向上部做“之”字形密集划线。注意：切勿划破培养基。也可用接种针在斜面培养基的中央划一条直线接种，可观察不同菌种的生长特点。

8）塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。注意：塞棉塞时，不要移动试管，以免试管在移动时纳入不洁空气。以上所述的无菌操作过程见图2-5。



9）灼烧接种环：将接种环灼烧灭菌后放回原处。

10）培养：将接种好的试管于37℃培养箱中培养，24h后观察生长情况。

3．液体接种

（1）斜面菌种接种液体培养基

1）接种的操作：同上。

2）接种：用接种环取少量斜面菌种移入培养基容器（试管或三角烧瓶等）中，将接种环在液体表面振荡或与容器壁轻轻摩擦，使菌苔散开。取出接种环，塞好棉塞，再轻轻摇动液体，使菌体均匀分布在液体中。

3）培养：将接种好的试管直立于37℃培养箱中培养，24h后观察生长情况。

（2）液体培养物接种液体培养基

1）接种的操作：同上。

2）接种：取无菌移液管（或移液器），伸入菌种管内吸取适量菌液，转接到待接种的液体培养基内。塞好棉塞，再轻轻摇动液体，使菌体均匀分布。

3）培养：将接种好的试管直立于37℃培养箱中培养，24h后观察生长情况。

4．穿刺接种

1）手持试管：按斜面接种法握持菌种管和半固体培养基管，靠近火焰。

2）取菌种：将接种针在火焰上烧灼灭菌，冷却后从菌种管中挑取少许待接菌菌苔，迅速移至半固体培养基管中。

3）穿刺接种（图2-6）：将接种针从培养基中央垂直刺入管部3/4深处，然后沿原路抽回。注意：接种针不能在培养基中左右移动，只能有一条穿刺线。



）塞管塞：试管口经火焰灭菌后，塞上棉塞。灼烧接种针。

5）培养：将接种好的试管置于37℃培养箱中培养，24h后观察生长情况。

5．平板接种

（1）划线法

1）倒平板（图2-7）：将融化的琼脂培养基冷却至45℃左右，在酒精灯火焰旁，用右手的无名指及小指夹持棉塞，左手打开无菌培养皿盖的一边，右手持三角烧瓶向培养皿里注入20mL左右的培养基。将培养皿稍加旋转摇动后，置于水平位置待凝。



2）划线：在酒精灯火焰上灼烧接种环，待其冷却后，以无菌操作取少量菌苔或菌液，伸入皿内，在平板上的一个区域沿“之”字形来回划线（具体方法参见实验9）。划线时，使接种环在琼脂表面作轻快滑动，切勿划破表面。

3）培养：划线完毕后，灼烧接种环，在皿底用记号笔注明菌种名称、日期、姓名（或学号），将培养皿倒置放入37℃恒温培养箱中培养。

（2）三点接种法一般用于霉菌菌落观察的接种方法。

1）倒平板：同上。

2）三点接种：无菌操作下，用接种针从斜面取少量孢子，针尖垂直地点接在平板培养基表面上，点接三次，接种结果见图2-8。注意：三点呈等边三角状，三点均位于培养皿的半径之中心。

3）培养：将平板保持倒置状态放入培养箱内（切忌来回翻动），适温培养1周。

（3）涂布法

1）倒平板：同上。

2）取菌液：用1mL无菌吸管吸取经适当稀释的菌液0.2mL于平板中。

3）涂布：用无菌涂棒在平板表面均匀涂布（图2-9）。

4）培养：室温下静置5～10min后，倒置于37℃恒温箱中培养24～48h。

【实验报告】

1．实验结果观察并记录用不同接种方法培养得到的细菌菌落形态特征，并列表比较几种细菌的菌落特征。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司