实时荧光定量PCR（Real time PCR）是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，并对起始模板进行定量分析的方法。其涉及域包括：临床疾病诊断、动物检验检疫、食品安全和科学研究等。在xin型guan状病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革热、感染性腹泻等的检测、诊断和治疗上发挥着重要作用。

实时荧光定量PCR法可分别为SYBR Green l荧光染料法和Taqman探针法。日常进行核酸检测就是运用Taqman探针法，新guan病毒核酸检测也是利用此项技术。该法高度特异，其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

在Taqman探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针的5’端标记有报告基团（Reporter，R），如FAM、VIC等，3’端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q），如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器不能检测信号。随着PCR反应的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’→5’外切核酸酶活性被探针切断，报告基团远离淬灭基团，能量不能被吸收，就产生荧光信号。因此每经过一个循环，荧光信号就和目的片段一样有一个同步指数增长过程。

这里涉及基线和CT值的概念。基线是用来确定背景的荧光信号强度的参比对照，相当于PCR指数扩增期以的荧光强度水平。CT值是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，其由扩增反应体系中模板的初始浓度决定。

与传统PCR相比，实时荧光定量PCR有着以下优点：

1．检测结果既可以定性，也可以定量；

2．检测灵敏度高；
 

3．无需进行凝胶电泳实验，节省实验时间，提高了效率。

图1 Taqman探针法工作原理

图2 实时荧光定量PCR的几个主要参数


 

原创作者：上海远慕生物科技有限公司