用Trizol法沉淀RNA容易有一些杂质的。部分色素是会和RNA一起沉下来。这种情况可以用75%冷的乙醇多洗几遍。对后续qRT-PCR多数情况下没什么影响。
另外可以用硅胶柱法纯化RNA,色素残留会少一些。
RNase污染的10大来源1:手指头 – 手指头是外源酶的第1来源,所以必需戴手套并且频繁更换。另外,口罩也必需戴,因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
2:枪头,离心管,移液器 单纯的灭菌是不能灭活RNase的,所以枪头和离心管要用DEPC处理,即使是标明为DEPC处理过的。移液器/好是用的,用用75%的酒精棉球搽拭干净,尤其是杆子;另外,一定不要使用褪头器。
3:水/缓冲液 一定要确保无RNase污染。
4:实验台面起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。
5:内源 Rnase 所有组织均含内源酶,故组织用液氮速冻是降低降解的/好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便,但对有一些内源酶含量很高的组织,却是唯1的办法。
6:RNA 样品 RNA抽提产物可能都会含痕量的RNase污染。
7:质粒抽提 质粒抽提往往用到RNase降解RNA,残留的RNase要用 Proteinase K 消化,PCI 抽提。
8:RNA 保存 即使低温保存,痕量的RNase亦会导致RNA降解。长/期保存RNA的/好办法是盐/醇悬液,因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
9:阳离子 (Ca, Mg) 在含这些离子时,80℃加热5分钟会导致RNA被剪切,故如果RNA需要被加热,保存液需要含螯合剂(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。
10:后续实验所用的酶 酶均有可能被Rnase污染。
原创作者:上海远慕生物科技有限公司