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PCR反应的核心成份——DNA聚合酶的选择
阅读次数:103 发布时间:2024/3/13 10:17:00
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 PCR即聚合酶链式反应,对于常年狂奔在实验室的实验人来说并不陌生。那么,对于PCR反应的核心成份,DNA聚合酶,你选对了吗?

常见的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根据耐热性来分可分为耐热酶和常温酶。耐热聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等,常温聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根据保真度来分,高保真聚合酶 Pfu、KOD、Phanta 等,普通聚合酶 Taq 等。



DNA聚合酶的功能

1)通过核苷酸聚合反应,使DNA链沿5’→3’方向延长(DNA聚合酶活性)[1]

2)催化由3’端水解DNA链(3’→ 5’核酸外切酶活性,用于切除错配的碱基)[1]

3)催化由5’端水解DNA链(5’→ 3’核酸外切酶活性,用于切除引物)[1]

4)催化由3’端使DNA链发生焦磷酸解

5)催化无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷酸三磷酸之间的焦磷酸基的交换

面对如此之多的选择,大多数刚进实验室的新生们默默表示,选择恐惧症犯了……那么,解决的方法是,根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶。比如:常规的 PCR 扩增和菌液鉴定,长度小于 5kb 的片段,保真度要求不高,使用 Taq 酶扩增即可。选用 Mix 的形式,混样更加简单,操作更加便捷。如果混样泡沫多,想灭掉泡沫的话,推荐大家使用 Green Taq Mix。想要获得较高的产量,可以选择 Taq Plus DNA 聚合酶,相对于 Taq 酶扩增性能更强。

1. 选择热启动酶降低非特异性扩增

在使用 Taq 酶进行扩增时,有时会出现非特异性扩增,可能的原因可以从模板、引物、体系、程序中一一排查。如模板是否被污染,引物特异性如何,Mg2+浓度偏高等等,其中一个不可忽视的原因是 DNA 聚合酶的种类是否合适。如果排查了其它原因仍旧有非特异性产物,可以选择热启动酶重新实验,即可有效减少或消除体系中其它产物的积累。常用的热启动酶分为两类:一类是化学法修饰的热启动酶,如 Ace Taq ,预变性 95℃5 - 10 min 即可释放酶活;一类是抗体法修饰的热启动酶,如 Champagne Taq ,预变性 95℃30s 即可释放酶活。使用时注意预变性时间,方能获得满意的扩增效果。

2. 选择 Lamp 扩增长片段

大于 5Kb 的长片段又该如何扩增呢?如果实验对保真度的需求不高,那么就可以使用 LAmp DNA 聚合酶。其保真度是 Taq 酶的 6 倍,可扩增超过 20Kb 的基因组、cDNA 片段,对于低拷贝、低纯度、以及不同 GC 含量的模板都具有很高的成功率。

3. 选择高保真酶快速高/效扩增

如果实验对保真度要求较高,在选择 DNA 聚合酶的时候就需要使用高保真酶,如 Pfu、KOD、Primerstar、Phanta 等。三者都属于第1代高保真酶,已在市场中广泛使用。诺唯赞科研团队的大力改造生产的 Phanta 系列的高保真酶,保真度达到了 Taq 酶的 50 倍,扩增性能、扩增长度、产量、模板适应性都显著提升。Phanta Max 保真度是 Taq 酶的 53 倍,Pfu 的 6 倍,对于质粒等简单模板有效扩增长度可达 40kb,cDNA 有效扩增长度可达 10kb,基因组有效扩增长度可达 20kb,适合于各种 GC 含量的扩增,可用于多种样本的直接 PCR 如植物叶片、全血等。且扩增仅需 30s/kb,甚至于 2kb/s。如此卓/越,爱不释手了吧?

4. 选择直接扩增试剂盒对粗品扩增

xxx生产的各种直扩试剂盒,直接对粗品进行扩增,大大减少了实验的工作周期。如小鼠基因型鉴定可以直接使用 One Step Mouse Genotyping Kit,全血扩增可以直接使用 Blood Direct PCR Kit V2。

原创作者:上海远慕生物科技有限公司

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