RNA和DNA提取:裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异,但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。
Chaotropes(离液剂)的作用:Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。
洗涤剂:除了离液剂外,裂解缓冲液中通常还有一些去污剂,以帮助蛋白质溶解和裂解。
溶菌酶和蛋白酶K:根据样品类型,也可以使用酶进行裂解。蛋白酶 K 就是其中,实际上在这些变性缓冲液中效果较好;当蛋白质变性增多,蛋白酶 K 的作用也会相应增强。然而,溶菌酶在变性中不起作用,因此溶菌酶处理通常在添加变性盐之进行。
RNA和DNA提取实验中的问题
1.产量低
如果您遇到的 DNA/RNA 产量低于您对样品的预期,则需要考虑许多因素。通常,这是一个裂解问题。不完/全裂解是产量低的主要原因。它也可能是由不正确的绑定条件引起的。确保使用新鲜的优/质乙醇(100% 200 标准)稀释缓冲液或添加到结合的步骤。劣质乙醇或旧库存可能已经吸收了水分,并且浓度不正确。如果洗涤缓冲液制备不正确,您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。
2.低纯度
如果提取的 DNA 被蛋白质污染(低 260/280),那么您可能开始时样品过多,而蛋白质没有完/全去除或溶解。
如果 DNA 的 260/230 比率不佳,则问题通常是结合或洗涤缓冲液中的盐分。确保使用/高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液,如果问题仍然存在,请再次洗涤色谱柱。
与其他样品相比,一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题,因为腐殖质在提取过程中会被溶解。
腐殖质的行为与 DNA 相似,很难从硅胶柱中去除。
3.降解
降解问题是RNA制备中常常到的问题。因为在 RNA 提取过程中,样品储存不当或裂解效率低等情况都会导致降解。对于 DNA 提取,降解不是一个大问题,因为对于 PCR,DNA 可以被剪切并且工作正常,如果不希望有较多剪切的 DNA,可以使用弱裂解的方法。
PCR 清理时的注意事项PCR 净化其实并不是 DNA 提取技术本身,但它是一种效率高且简单的技术,它只是添加高浓度的结合盐(通常每体积 PCR 反应 3-5 体积盐)和离心来过滤。
在实验过程中,PCR Clean-up 试剂盒出现故障也会导致整个实验功亏一篑。
因为在PCR 反应中有较多吸收 260 度紫外线的物质,比如:核苷酸、去污剂、盐和引物。所以,PCR 净化试剂盒经常无法正常工作可能是由于 PCR 反应失败所造一般成较难清理。
原创作者:上海远慕生物科技有限公司