免疫荧光试验定义一种免疫标记技术。用于检测相应抗原或抗体。即用荧光素与抗体连接成荧光抗体,再与待检标本中的抗原反应,置荧光显微镜下观察,抗原抗体复合物散发出荧光,借此对标本中的抗原进行鉴定或定位。
⑴基本原理染色程序分为两步,第1步,用未知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原标本上,在湿盒中37℃保温30min,使抗原抗体充分结合,然后洗涤,除去未结合的抗体。第二步,加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第1步发生了抗原抗体反应,标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合,从而可鉴定未知抗体。
⑵试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
荧光标记的抗人球蛋白抗体:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释。
搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)
荧光显微镜
玻片架
滤纸
37℃温箱等。
⑶实验步骤1)滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原标本片,10min后弃去,使标本片保持一定湿度。
2)滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本,覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内,37℃保温30min。
3)取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗1-2次,然后按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不时振荡。
4)取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
5)将玻片平放在有盖搪瓷盒内,37℃保温30min。
6)重复操作3。
7)取出玻片,用滤纸吸去多余水分,滴加一滴缓冲甘油,再覆以盖玻片。
8)荧光显微镜高倍视野下观察,结果判定同直接法。
⑷注意事项1)荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长 ,会使荧光减弱。
2)每次试验时 ,需设置以下三种对照:
① 阳性对照:阳性血清+荧光标记物
② 阴性对照:阴性血清+荧光标记物
③ 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物
3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥。
4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物,应始终保持在已知抗原标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色 。
原创作者:上海远慕生物科技有限公司