细胞培养被支原体污染是个性问题，在细胞培养中支原体感染发生率达到63%。支原体是一类无细胞壁，形态呈高度多形性，为圆形、丝状或梨形，其直径仅有0.13～0.18μm，变形能力大，故能通过滤菌器，突出的结构特征是没有细胞壁，对作用于细胞壁生物合成的抗生素不敏感。研究表明，支原体能耗尽营养物，促进代谢积累，导致pH改变，对细胞造成多种影响，包括生长状况、生化特性、代谢、免疫、以及细胞存活等多方面的改变，继而干扰实验结果，或造成无法解释的差异。更加不幸的是拯救被感染的细胞几乎是不可能的。

那如何检测你的细胞是否收到支原体的入侵呢？下面介绍了几种检测方式，或许对你的实验有用。


分离培养法

分离培养法是支原体检测的金-标方法，其检测精-确度-高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上狂生长，终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金-标准。

但是，分离培养法也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如支原体M. hyorhinis。

DNA检测法，也称直接培养法

将可疑样品与指示细胞共同培养，一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。

但是这种方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。且Hoechst荧光染色：操作复杂，操作不当易造成假阳性或假阴性。

PCR法

PCR法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其PCR引物可特异扩增支原体基因组中rDNA保守序列，包括所有已知的支原体，及细胞培养过程普遍遇到的种属，例如M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. hyorhinis、M. neurolyticum、M. orale、M. pirum、M. pneumoniae、M. pulmonis、M. salivarium 和U. urealyticum。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。

PCR法快速，简便，具有强扩增能力和高的敏感性，可以检测大多数支原体，但谨慎起见-好同时使用另一种检测方法来进行验证。PCR法检测支原体只需几个小时，是快但也是不灵敏的支原体检测方法。

酶学检测

酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中，在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP，随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。

-后，建议你进行定期检测

支原体感染会影响细胞的正常生长，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司