1、植物天然产物分离纯化的意义

广义而言，任何生物分子都是一种天然产物，但是这一概念通常用来指次生代谢产物(secondarymetabofite)，又称二次代谢产物，即有机体所产生的、分子量小于1500的那些小分子。而这些小分子且并非是有机体生存所必需的，不象更为普遍的大分子诸如蛋白质、核酸以及多糖等那样，它们构成了生命更为基础过程中的基本结构。植物中的次生代谢产物其分子较小且结构丰富多彩，具有更为多变的化学性质，其中不少还具有明显的生理活性，它们构成了植物天然产物研究的物质基础。

2、植物天然产物分离纯化的策略

要想得到一个高纯度、高产量和低成本的天然药物有效成分，不仅需要对各种分离纯化技术全-面地了解，也要掌握分离纯化的基本策略，在工艺设计和优化中常常需要考虑纯度、回收率、成本和安全性。

(l)纯度:目标产物的终用途决定了纯度的要求，如用于静脉注射的药物的纯度一般要求达到99.5%。天然产物提取所达到的纯度与为之所付出的工作量之间常常接近于指数关系。从一种复杂混合物的粗品开始，除去其中不需要的一半以上的杂质通常相对来说比较容易，但要除去其中少量的杂质是非常艰辛和繁琐的。

仅)回收率:在天然产物的提取中每一步中都会发生产物的损失，获得非常高的纯度必然会损失更多的目标产物，因此生化工程师必须进行过程优化以及从实验室到生产的放大研究，再考虑纯度的同时应尽可能地提高回收率。

(3)成本:分离纯化设备及材料费用常常占整个生产费用的50%一90%。所需纯度和提纯所需时间是决定终成本的两个关键因素脚l。高纯度往往需要较昂贵的提纯设备或更多的提纯步骤，造成很高的生产成本。提高分离的效率，减少提纯步骤是降低成本的重要途径。

(4)安全性:一方面，作为药物的天然产物有效成分必须去除各种墨幽中文有害甚至有毒的成分以及其他能引起副反应的杂质;另一方面，分离过程应尽量避免环境的污染，减少有毒有害溶剂的使用，消除对人员伤害的可能。

3、植物天然产物分离纯化的特点

与一般的分离技术相比，生化分离技术有着自身的特点。而植物天然产物的分离不同于那些更为普遍的生物大分子的分离，因为他们的分子较小，而且与相对均一的蛋白质、核酸以及碳水化合物相比具有更为多变的化学性质，这些性质在分离过程中必须予以考虑。到目为止，植物天然产物分离纯化所面临的难点有:

(l)有效成分的含量低，难于富集。例如抗癌药物紫衫醇在植物体内的含量一般-高只有0.06%一0.07%;

(2)分离体系非常复杂:一方面，植物提取物中的化合物类型众多，结构复杂，数目庞大，可能既有像核酸、蛋白质和多糖这样的大分子，也有黄酮、有机酸、生物碱、菇类以及无机盐等类型的小分子化合物;另一方面，对同一类型的有效成分，大部分也存在着许多从同一体代谢得到的结构类似物;

(3)分离过程中的影响因素较多，不同产地、季节的植物，以及同一植物的不同部位中有效成分的含量和杂质的特性也往往不同，另外许多天然产物的结构不稳定，己降解或转化。为解决这些难点，需要利用多个步骤，不断变换分离方法，设计并实施高-效的生化分离技术路线，将整个分离过程的有关步骤进行组合，使之具有简单，快速，低耗的特点以及良好的操作弹性。

4、分离纯化方法的基本原理

分离纯化方法的基本原理可以概括为两类:

(l)利用混合物中不同组分分配系数的差别，将其分配至两个或若干个物相中，如盐析、沉淀和萃取等;

(z)将混合物至于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配到不同区域而达到分离目的，如超速离心与超滤技术等。因此，在选择一种分离纯化技术之必须了解目标产物的一些理化性质(溶解性、性、带电性、生物特异性等)，这些性质可用来指导分离纯化技术的选择。

5、分离纯化技术的排序

植物天然产物一般都存在于植物细胞中，且目标产物含量可能非常低;另外由于分离体系中既有与目标产物性质差异非常大的杂质，也有理化性质差别不大的结构类似物，因此很难一步就能纯化出目标产物。在分离纯化过程中，一般要经过从植物中浸提，初分离，纯化和精致四个步骤。对于某些天然产物的纯度可能要求不高，仅需要其中的一个或者两个步骤，但大多数情况下都会涉及以下这四个阶段:

(l)浸提:浸提的目的是根据相似相溶原理，将存在于植物细胞内不同位置的产物提取到细胞外的液相环境中，同时可以除去大量的生物质如植物的纤维等。提取的第1步是要通过溶剂或水溶液将小分子的目标产物溶出。这可以通过一系列性顺序变化的溶剂提取，也可以通过采用像甲醇这样的通用溶剂将大部分天然产物溶出的同时，而且能够渗入细胞壁的物理屏障提高其从细胞质中的释放，然后再经过滤或离心除去不溶物。一般的，植物原料须经干燥并适当粉碎，以增大与溶剂的接触面积，提高提取效率【例。植物成分中，菇类、幽体等脂环类及芳香类化合物的性较小，易溶于氯-仿、乙-醚等亲脂性溶剂中;而糖贰、氨基酸等类成分则性较大，易溶于水及含水醇中;至于酸性、碱性及两性化合物，其溶解度将随pH值而改变。

(2)初分离:在初分离阶段，由于浸出液中物质十分复杂，目标产物的含量低，且在理化性质上与目标产物相似的杂质数量较多。因此初分离的目的常常是采用多步液一液萃取，吸附层析以及沉淀等分辨率相当低的分离方法，除去大部分的杂质成分，达到浓缩目标产物的目的。初分离产物应包含所有感兴趣的天然产物而只含有少部分的初提物，体积相对较少，可用后续高分辨率提取。在初分离阶段选择分辨率较高的分离方式一般不太合适，因为高分辨率的分离方法通常是根据物质的两个以上的理化性质差异而建立起来的，负荷能力往往都比较小;另外，在杂质多的情况下，位点效应比较严重，大量的理化性质相近的分子在相同的条件下彼此竞争占据某一位点，因而只能在特定区域得到一些理化性质相近的同类物质，使得收集馏分中掺杂大量的类似物，给后续的纯化步骤造成很大的困难。

(3)纯化:经初分离后，需要采用高分辨率的分离步骤来除去仍旧存在的杂质组分。由于这些杂质组分与目标产物之间存在着某些相似性，因而会在两步分离之后依然与目标产物共存。尽管初分离所得到的可能只是用于后续提纯的粗馏分，但在纯化阶段，通过对分离方法进一步加以调整和改进，就可以使分离纯化达到预期的目标。在纯化阶段，所采用的分离方法需要根据物质的分配系数，分子量大小，性高低，离子电荷性质及外界环境条件的差别等因素来进行选择，而不同的分离方法也总是在特定的条件下才能发挥-佳作用。

(4)精制:这一步通常包括脱色，去除微量杂质或热源，冷冻干燥或者结晶等。由于这一步产物基本上已经很纯，且所用的工艺也比较成熟，因此，和三个阶段相比，这一步相对来说比较简单。总之，将各种分离纯化手段有机地进行组合，合理地安排分离方法的先后顺序，同时尽可能地实现各个步骤之间的偶合，使植物有效成分得到高-校快速的分离，这是对每一个从事天然产物分离纯化工作人员的挑战。

原创作者：上海远慕生物科技有限公司