技术文献
一、实验目的
(1)掌握蛋白质盐析沉淀的基本原理与操作。
(2)掌握蛋白质透析分离的基本操作。
二、实验原理
蛋白质是亲水胶体,借助水化膜和同性电荷(在pH7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷)相互排斥作用维持蛋白质胶体的稳定,向蛋白质溶液中加入中性盐可破坏这些稳定因素,使蛋白质沉淀析出,称为盐析。盐析所得到的蛋白质沉淀经透析或用水稀释以减低或除去盐后,蛋白质能再次溶解并恢复其天然结构和生物活性,称为透析。由于蛋白质分子量很大,其颗粒直径范围在1~100nm内,不能透过半透膜。选用合适孔径的半透膜可使小分子物质透过,而蛋白质不能透过半透膜,从而可以除去与蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质。蛋白质盐析常用中性盐,如硫酸铵、硫酸钠、NaCl等。蛋白质经盐析沉淀后,需脱盐才能获得纯品。脱盐常用的方法为透析法。由于蛋白质分子量较大,不能透过半透膜,而无机盐及其他低分子物质可以透过,故利用透析法可将盐析得到的蛋白质进行纯化。将蛋白质溶液装入透析袋内,袋口用线扎紧,然后将其放进蒸馏水中,蛋白质分子量大,不能透过透析袋而被截留在袋内,而小分子盐由于透析袋内外浓度差,可透过透析袋,通过不断更换袋外蒸馏水,直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间,为保证蛋白质不变性,透析宜在低温下进行。
三、实验材料与试剂
1.实验材料
10%鸡蛋清溶液,含鸡蛋清的氯化钠蛋白质溶液。
2.主要实验试剂
饱和硫酸铵溶液:称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中,在70~80℃下搅拌溶解,室温放置过夜,杯底析出白色晶体,上清液即为饱和硫酸铵溶液。硫酸铵晶体、1%硝/酸银溶液等。
四、实验步骤
1.透析袋的预处理
为防干裂,新透析袋出厂时常用10%甘油进行处理,并含少量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质,需除去。将透析袋剪成100~120mm的小段,用50%乙醇煮沸1h,再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和0.001mol/LEDTA溶液洗涤,后用蒸馏水冲洗3~5次(新透析袋如不作上述特殊处理,也可用沸水煮5~10min,再用蒸馏水洗净即可使用)。透析袋一端用橡皮筋或线绳扎紧,也可用特殊的透析袋夹夹紧,从另一端灌满水,用手指稍加压,检查是否有渗漏,没有渗漏后方可使用。处理好的透析袋保存于蒸馏水中待用。
2.蛋白质盐析
取10%鸡蛋清溶液5mL于试管中,加入等量饱和硫酸铵溶液,微微摇动试管,使溶液混合后静置数分钟,蛋清蛋白质即可析出。如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液,观察蛋白质的析出。取少量沉淀的蛋白质,加水稀释,观察沉淀是否会再次溶解。
3.蛋白质的透析
注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白质溶液5mL于透析袋中,将袋的开口端用线扎紧,并悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中,开口端位于液面之上。10min后,自烧杯中取出1mL溶液于试管中,加1%硝/酸银溶液一滴,如有白色氯化银沉淀生成,则证明蒸馏水中有Cl-存在。再自烧杯中取出1mL溶液置于另一试管中,加入1mL10%氢氧化/钠溶液,然后滴加1~2滴1%硫酸铜溶液,观察有无蓝紫色出现。每隔20min更换蒸馏水一次,数小时后可观察到透析袋内出现轻微混浊,此为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。实验记录透析完成所需的时间。
五、注意事项
蛋白质溶液用透析除盐时,正负离子透过半透膜的速度不相同,如(NH4)2SO4中的 透析速度快,而透析过程中膜内的 会生成H2SO4,使膜内蛋白质溶液呈酸性。因此,为避免蛋白质变性,用盐析法纯化蛋白质时,开始时应用0.1mol/L的NH4OH透析。此外,为了保证蛋白质在透析过程中不发生变性,可以将透析过程置于低温下进行。
原创作者:上海远慕生物科技有限公司
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