技术文献
一、原理
deae-sephadex a-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶a-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。pH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被deae- sephadex a-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。
1、试剂
(1)盐析提取的人γ球蛋白
(2)0.5N NaOH,0.5N HCl 2M NaCl,10%NaN3
(3)DEAE-Sephadex A-50,聚乙二醇(PEG)
(4)0.1M,PH7.4 PB(配制见盐析部分)
2、器材
(1)层析玻璃柱(1.3×40cm),滴定铁架,自由夹,螺旋夹,尼龙纱(200目)
(2)普通冰箱,751桮型紫外分光光度计,电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶),PH计
(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸
(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等
3、操作步骤
(1)deae-sephadex a-50预处理
称deae-sephadex a-50(下称a-50)5g,悬于500ml蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。按每克a-50加0.5mol/l naoh 15ml的比例,将a-50浸泡于0.5mol/lNaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/l HCl同上操作过程处理,后以0.5mol/l NaOH 再处理一次。处理完后,将a-50浸泡于0.1mol/l pH7.4PB中过夜。
(2)装柱
①将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
②将0.1mol/l ,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的a-50。等a-50。等a-50凝胶沉降2~3cm高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1ml/min,同时连续倒入糊状a-50凝胶至所需高度。
③关闭出水口,待a-50凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
(3)平衡
启开出水口螺旋夹,控制流速12~14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。
(4)加样及洗脱
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积2%,蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内, 至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2~3次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12~14滴/min。
(5)收集
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。
(6)测蛋白
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD 280nm, 与OD 260nm,按公式计算各管蛋白含量。并以OD 280nm为纵座标,以试管编号为横座标,绘制洗脱曲线。
(7)合并、浓缩
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以peg(mw6000)浓缩至所需体积,加入0.02% NaN3防腐,于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。
(8)a-50凝胶的再生
在柱上先以2mol/l NaCl洗脱蛋白至流出液的OD 280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将a-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时,以无水/酒精洗2次, 再置50℃温箱烘干,装瓶内保存。
二、注意事项
1、柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就能获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱的直径增加,使流体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。
2、纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与a-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析。
3、所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。
4、洗脱过程中应严格控制流速,切勿过快。
5、上样的体积要小,浓度不宜过高。
6、加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。
原创作者:上海远慕生物科技有限公司
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