PCR实验时，我们有时候会遇到目的基因得率低，或者根本扩不出来的情况，不管是PCR的实验王者，还是初级实验小白，都需要逐个排查问题，那么我们需要考虑哪些因素呢？

今天这一篇干货，帮您彻底解决问题。
 

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首先考虑的问题，是不是DNA模板的问题呢？

1. 如果模板质量太差？

那么检查DNA模板的纯度和完整度，保证你的模板中不含有PCR抑制剂。在分离DNA时，尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要，可通过凝胶电泳检测模板DNA完整性。

将DNA保存于分子级别的水或TE缓冲液 （pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。

2. 如果是模板浓度太低？

建议使用DNA纯化试剂盒分离模板DNA时，应严格遵循试剂盒生产商的建议。查阅用户手册和疑难问题指南，改善较低的DNA质量。如果采用化学或酶促DNA纯化方案，应确保无PCR抑制剂残留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。使用70%乙醇再纯化或沉淀和洗涤DNA，去除可能会抑制DNA聚合酶的残留盐分或离子（如， K⁺, Na⁺等）。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类聚合酶对土壤、血液和植物组织携带的常见PCR抑制剂具有较好的耐受性。

3. 如果是DNA模板量不足？

建议检查 DNA起始量 ，如有需要适当增加起始量。 选择具有高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。适当增加PCR循环数。

4. 如果需要扩增的目的片段比较复杂（如，高GC含量或含二级结构）？、

建议选择具有相应的扩增试剂盒，比如适合高GC含量片段的PCR试剂盒。或者选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，更适合扩增困难靶标。 使用 PCR添加剂或辅助溶剂 ，促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。增加 变性时间或温度 ，从而高效解离双链DNA模板。

5. 如果目的片段太长？

建议直接使用长片段设计的PCR试剂盒，或者确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为 长片段PCR设计的DNA聚合酶。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性。根据扩增子长度，增加延伸时间。

或者是引物的问题？

6. 考虑引物浓度是不是不是*优的？

建议预实验优化引物浓度（范围通常为0.1–1 μM）。对于长片段PCR和使用简并引物的PCR，*小起始浓度为 0.5μM。

7. 引物设计有问题？

可以使用多种引物设计软件比如Primer Premier等，或者使用在线 引物设计工具 。确保引物针对目的片段具有特异性。 确认引物与正确的目标DNA链互补。

也许是其他试剂的问题？

8. MgCl2 浓度太低？

镁离子（Mg²⁺）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg²⁺ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。在PCR中，标准的 Mg²⁺ 终浓度范围为1–4 mM，建议优化滴定增量为0.5 mM。 Mg²⁺ 浓度过低会降低聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面， Mg²⁺ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导致的复制错误。

还有可能是PCR循环设置不理想呢？

9. 变性效果不理想？

建议优化DN变性时间和温度。变性时间短、温度低可能无法获得良好的双链DNA模板解离效果。相反，变性时间长、温度高可能会降低酶活性。

10. 退火效果不理想？

尽量使用 梯度热循环仪 ，以1–2°C增量逐步优化退火温度。*佳退火温度通常比引物Tm低 3–5°C。当使用 PCR 添加剂或辅助溶剂 时，应调整退火温度。使用指定DNA聚合酶在其*佳缓冲液中的 推荐退火温度 。DNA聚合酶不同，则引物对的退火温度也不同。

11. 延伸效果不理想？

选择适合于扩增子长度的延伸时间。

在扩增长片段（如，>10 kb）时，降低延伸温度（如，降至68°C）可保持酶活性。

使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶，在较短的延伸时间内也能实现 稳定的扩增 。

12. PCR循环数不合适？

调整循环数（通常为23-35个循环），以获得合适的PCR产物得率。如果DNA起始量低于10拷贝，则将循环数增加至40。