一.实验原理

质粒可携带一种或多种抗生素抗性基因，其赋予携带它们的细菌对特定抗生素的抗性。研究人员可以通过人工选择（即在抗生素存在下培养细菌），轻松地将含有该质粒的细菌与不含有该细菌的细菌分离。

Luria肉汤（LB）是一种富含营养的培养基，通常用于培养实验室中的细菌。向LB中添加琼脂导致形成细菌可以生长的凝胶，因为它们不能消化琼脂但可以从LB内收集营养。向该凝胶中添加抗生素只允许选择那些对该抗生素具有抗性的细菌 - 通常由携带抗生素抗性基因的质粒赋予。

LB琼脂平板经常用于分离携带特定质粒的细菌的个体菌落。然而，液体培养物能够支持更高密度的细菌，并用于培养足够数量的细菌以分离足够的质粒DNA用于实验用途。

二.试剂及实验器材准备

1.液体培养基配制：

胰蛋白胨Tryptone：10g

酵母粉Yeast：5g

NaCl：10g

dH2O定容至1000ml

2.LB平板配制:

胰蛋白胨Tryptone：10g

酵母粉Yeast：5g

NaCl：10g

琼脂糖：12g（工作浓度6-25g/L）

dH2O定容至1000ml

3.无菌平板（不可高压）：通常使用60 mm x 15 mm平板，200ml琼脂浇筑4-5个平板（若琼脂太少过夜孵育后容易干裂），可在其上单独区分*多约100个菌落

4. Falcon细胞流式管（不可高压）5.可高压灭菌的烧瓶：（用1L瓶制备400ml琼脂，在500ml瓶中制备200ml琼脂，需要额外的空间防止沸腾。）

6.抗生素：1000倍的储备溶液(氨苄青霉素钠,库存浓度100mg/ml，溶解后，0.22um过滤除菌，分装，-20℃保存数月。加入培养基时一定要等灭菌后的培养基冷却到40-50℃时再加入。含氨苄青霉素的培养基平板在4℃可保存2周。)

三.实验步骤

1.溶解质粒： 将含目的基因质粒的 纸剪下（比画得圈稍大），并剪成碎片，放入无菌EP管，加20到50ul无菌水或TEbuffer， 可用枪头将滤纸捣碎，室温过夜（或为了促溶，还可60℃水浴）。后漩涡振荡5min，离心，取上清即为质粒用于后续转化。

2.LB液体培养基、LB平板粉末 搅拌溶解后，121℃高压灭菌半小时，高压灭菌过程中高压釜胶带会变暗。液体LB 无菌环境下冷却至室温，放置4℃冰箱备用；LB平板 熔融凝胶混合物在凝固前转入40-50℃（视抗生素加入培养基温度而定）水浴锅，至少5分钟，备用。

3.准备培养皿、Falcon细胞流式管，紫外线消毒30min；（在培养皿上标记日期、抗生素特性。）

4.准备抗生素（要制备终浓度为100 ug/mL氨苄青霉素钠的平板，则应制备100,000 ug / mL（100 mg / mL）的储备溶液。测量100毫克氨苄青霉素钠粉末，将其加入1毫升水中，通过涡旋溶解，并过滤灭菌。）

5.添加抗生素至LB液体培养基、LB平板熔融凝胶混合物中（温度不宜过高，40-50℃（视抗生素分解温度而定，氨苄青霉素钠加入温度为40-50℃），防止抗生素分解）

6.浇筑LB平板：浇注后将盘子旋转以除去气泡，确保琼脂在板底部均匀分布，凝固后倒置。200ml琼脂浇筑4-5个平板（若琼脂太少——板过薄，过夜孵育后容易干裂）若浇筑过程瓶中的琼脂凝固，可再次通过高压灭菌器或微波炉将琼脂重新液化（用微波炉时防止沸腾！）室温下固化大约需要30min，在室温下过夜使之干燥。在过夜干燥后，将板在4℃下（用PE手套包好）储存直至使用。

7.取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷（提前冰上预冷1.5mlEp管）的离心管中，置于冰浴中。

注意：一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul，可以根据实际情况分装。所用DNA体积不超过感受态细胞悬液体积的1/10。（根据加入质粒体积提前准备无菌10ul无滤芯枪头）

8. 向感受态细胞悬液中加入目的DNA/ pUC19质粒（对照：证实感受态细胞是否有问题）（100ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，轻弹混匀，在冰浴中静置30min。

9. 将离心管置于42℃水浴中放置60-90s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min，该过程不要摇动离心管。

注意：此步骤也可将离心管置于室温进行，夏季或室温较高时，可放置5-8min， 如果室温较低，可延长时间至8-15min。条件允许建议使用42℃热激方法。

10. 向每个离心管中加入900ul无菌的LB培养基 （不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45 min (将1.5mlEp管水平放置，充分摇混匀)，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

11. 将离心管内容物混匀，吸取100ul （次涂板，可设置不同的梯度：20ul、50ul、70ul、100ul）已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收(15-20min)，倒置平板，37℃培养12-16h（过夜）。

注意：涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm, 2min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板。）

12. 使用无菌枪头或牙签，从LB琼脂平板上选择一个菌落。

13. 将枪头或牙签放入液体LB +抗生素中并旋转。

14. 将细菌培养物在37℃下在振荡培养箱中 180rpm孵育12-18h。

15. 孵育后，检查生长，其特征在于培养基中的混浊雾度。

注意：良好的阴性对照是LB培养基+抗生素，没有任何细菌接种。过夜孵化后，您应该看到这种培养物没有生长。

对于细菌的长期储存，选择甘油。

1、配制30%（体积分数）的甘油水溶液,离心管若干灭菌备用.

2 、将细菌用富集培养基摇瓶培养过夜,根据保藏要求（有些要求高的项目中菌要达到一定OD值）培养.

3 、将菌液和灭菌的甘油水溶液按照2:1的体积比例在离心管中混匀（使*终甘油浓度为10%,其实甘油多点也没关系）,-70°冰箱保存.

16. 用小提试剂盒从大肠杆菌培养物中分离质粒DNA。

17. 样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，*明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

18. 质粒纯化

1) 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/L无菌乙酸钠溶液。

2) 加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。

3) 4℃，高速离心机14000rpm，离心20min.

4) 弃去上清，70%乙醇洗2次。

5) 空气干燥，可置超净工作台干燥。

6) 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。

7) 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

四.提示和常见问题

(1)高拷贝质粒和低拷贝质粒有什么区别？

拷贝数是指单个细菌细胞内单个质粒的拷贝数。大质粒通常具有低拷贝数（每个细胞大约一个或两个拷贝）并且它们需要生长更长的时间段（大约18-30小时）。另一方面，较小的质粒可以大量存在，每个细胞50个或更多，并且具有高拷贝数。高拷贝数质粒应该仅需要平均生长12-16小时。无论质粒大小如何，质粒的某些特征可使其低拷贝。请参阅质粒的信息页面以确定您的质粒是高拷贝还是低拷贝。

(2)过夜孵化后，我没有任何增长。什么地方出了错？

尝试将文化培养更多时间。一些细菌培养物生长得更慢。此外，在30°C而不是37°C温育的细菌通常需要更长的孵育时间。

仔细检查LB培养基中的抗生素是否与质粒上的抗生素抗性相匹配。

如果LB琼脂平板上的细菌不是新鲜的，你应该将细菌划到新的LB琼脂平板上，然后在液体培养基中生长。

更多的曝气可能有助于增加培养物的密度。通常培养物在150-250rpm下摇动，将其增加至350-400rpm以获得更高的细胞密度。