一、实验的常用方法有直接法和间接法，方法的选择是实验的步：

方法                          直接法                                                                          间接法

步骤           将荧光标记的特异性抗体（抗原）                             先用已知未标记的特异性抗体（一抗）                                          直接加在抗原（抗体）上，经一定                             与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）

             的温度和时间染色，水洗—干燥—封片—镜检                与其反应，形成抗原—抗体—抗体复合物，

                                                                                                       水洗—干燥—封片—镜检

优点         操作简便、特异性高、非特异性染色少                        敏感性强，目前多采用间接法

缺点                             敏感性低                                                                   操作复杂

   

二、我们来看看实验的常见问题：

1、整个细胞片都出现荧光亮点？

答：原因有二：一是二抗浓度过高，适当降低二抗浓度即可。

二是二抗发生沉淀，可以使用过滤或者离心荧光标记二抗

2、信号弱或无信号，染色细胞过少？

原因                                                                                             优化方案

目标蛋白在细胞中没有表达                      制备细胞裂解液，用Western   Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达

表达目标蛋白的细胞过少                        标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定转染细胞系

细胞通透性差                                                    增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其它的通透剂

染色前的固定步骤破坏了抗原表位                                          改用其他固定方法

通透使抗原丢失                                                             减少通透剂作用的时间或强度

抗体不识别                                                                               换用其他抗体

一抗稀释度过大                                            同一样品按*佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定*佳的一抗稀释比例

二抗选择错误                                                                       使用正确的二抗


3、为什么我的镜下观察只有DAPI的蓝光，目的荧光几乎没有或者很弱？

答：出现这种现象很有可能是抗体比例太低，需提高抗体浓度，可配合提高二抗浓度；共聚焦的激发荧光强度不够大；二抗孵育时是否是对应的种属，比如本来需要山羊抗鼠结果加为山羊抗兔


4、为什么我的细胞核周围总是存在有一些蓝色的小点点？

答：此种情况一般是支原体污染所致，建议用杀支原体药2周后再检测，或者通过提高共聚焦机器背景值来覆盖支原体荧光


5、共定位的视野该如何选择？

答：共定位时，首先判断哪些细胞是转染成功的，比如我过表达了蛋白A，想做蛋白A和蛋白B的共定位关系，则在视野中寻找已成功转染蛋白A的细胞，一般荧光强度会显著高于周边其他细胞，再在这个细胞上观察蛋白B的表达，


6、视野中细胞与细胞之间存在散在的发光点。

答：有两种情况可造成：1，拍照时PBS量过少引起的非特异性；2，PBS未过滤，未溶解的残渣黏附而导致


三、除此之外，这些注意事项也要牢记

1、合适的抗体稀释比例

通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。

2、抗体特异性

免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子

3、细胞固定和通透

为达到*佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证*佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。

4、封闭条件的优化选择

为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前用封闭液封闭，这样可以减少非特异性的背景着色。封闭液可以选择二抗来源一致的血清，一般来说，血清价格比较昂贵，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以说是万能的封闭血清。另外封闭时间不易过长，30-60min即可，且封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育即可。

5、一抗二抗的选择

封闭过后需要一抗孵育，可以选择4度过夜孵育或者室温3h，以笔者的经验是一抗孵育4度过夜比较好，抗原抗体结合会比较充分。一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来，再根据自己具体的实验要求进行优化。如果抗体浓度过低，会造成信号太弱，如果抗体浓度过高可能会造成背景染色太强。荧光二抗个人感觉Alex flour荧光基团信号强于Dylight强于FITC。如果做免疫双标，一抗要来自不同种属，荧光二抗的光谱也要分开。