、DNA提取过程中各种试剂的作用及原理

DNA提取过程中各种试剂的作用及原理

1.溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：

(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要定的金属离子作辅基);

(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2.溶液II-NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。 在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6， 因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：

SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：

(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

(2)解聚细胞中的核蛋白。

(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下步操作中 (用RNase去除RNA时)受到干扰。

3. 溶液III－－3mol/L NaAc(pH4.8)溶液：

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。 所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性， 使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、 RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合.

二、提取DNA常用的方法

.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小为100-150kb

二.甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

三.玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

四.异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA(在异丙醇中可溶状态)

五.表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

六.加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

七.碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

三、为什么用无水乙醇沉淀DNA

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶， 乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的终含量占67%左右。 因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。

但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有定程度的溶解，因而DNA损失也增大， 尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵， 后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。般在室温下放置15-30分钟即可。

四、用乙醇沉淀DNA时为什么定要加NaAc或NaCl

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷， 减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时， 只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时， 其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理?

加进去的RNase本身是种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、*抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

在基因操作实验中，磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。