、无菌操作要求

1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。

2.进行接种食品样品时，必须穿用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作经紫外线消毒后使用。

3.接种食品样品时，应在进无菌室用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。

4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

7.接种环和针在接种细菌应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。

8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

二、无菌间使用要求

1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7平方米的小窗，以备进入无菌间后传递物品。

2、无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。

3、无菌间使用后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，也可以用雾化过氧化氢设备，法国欧菲姆设备实用，便捷。

4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。

三、消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

（）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法

1、灭菌准备

（1）所有需要灭菌的物品先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。

（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

2、装放

（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。

（2）大型高压蒸气锅：：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

3、设备检查

（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。

（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：

①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）。

②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。

③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。

④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。

⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。

（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：

①关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。

②夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。

③待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至

④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。

⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。

4、灭菌温度与时间

（1）干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。

（2）压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间

（二）间歇灭菌方法

1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。

（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。

（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。

（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。

2、血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。

（1）在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。

（2）将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。

3、煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min，加入0.02%甲醛，80℃煮60min均可达到灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应注意对物品的腐蚀性。

4、灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。

（1）物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。

（2）取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。

（3）培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。

（4）启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。

（5）取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。

（6）取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。

（7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。

（8）每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

四、有毒有菌污物处理要求

微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，律不得带出实验室。

1、经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统进行高压灭菌。

2、经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。

3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30min高压灭菌。

4、涂片染色冲洗片的液体，般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。

5、打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。

污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。

五、培养基制备要求

培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：

1、根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用对应用的试剂药品应进行质量检验。

2、PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试次。培养基PH值定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等般在调完PH后再加入。

3、培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。

4、盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。

5、培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。

6、每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。

7、目各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。

8、每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。

六、样品采集及处理要求

1、所采集的检验样品定要具有代表性，采样时应先对该批原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。

2、根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。

3、采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。

4、样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。

5、检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之者，可拒绝检验。

（1）样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。

（2）瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。

（3）按规定采样数量不足者。

对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。

6、样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。

（1）液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。

（2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。

（3）瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。

七、记录和报告的要求

1、检验室收到样品后，行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。

2、样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。