一、载体与质粒的区别
1.载体(Vector)的概念
把一个目的基因通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。
基因工程上所用的载体是一类能自我复制的DNA分子,其中的一段DNA被切除而不影响其复制,可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
载体的功能及特征:
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件:
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
具有较高的外源DNA的载装能力
具有多具有合适的筛选标记
种单一的核酸内切酶识别切割位点
2.质粒(Plasmid)的概念
质粒是生物细胞内固有的、能独-立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是DNA型的,少部分为RNA型。天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构,其分子量范围:1-300 kb。细菌质粒是基因工程中常用的载体。
质粒的基本特征:
质粒的自主复制性:质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,其DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,并根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为两大复制类型:
严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝
松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝
质粒的不相容性:任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现象称为质粒的不相容性,不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例:
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构,彼此不相容。
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构,彼此不相容。
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构,彼此不相容。
质粒的可转移性:革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类:
接合型质粒——能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞(接合作用),如F、Col、R质粒等。
非接合型质粒——不能在天然条件下独-立地发生接合作用如Col、R的其它成员。值得注意的是,某些非接合型质粒(ColE1)在接合型质粒的存在和协助下,也能发生DNA转移,这个过程由 bom 和mob 基因决定携带特殊的遗传标记:野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,包括:
物质抗性:抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物等。
物质合成:抗生素、细菌毒素、有机碱等。
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
二、质粒载体的分类
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷,不能满足克隆载体的要求,因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
质粒载体按功能分:
克隆载体—都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。
表达载体—具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
质粒载体按进入受体细胞类型分:
原核载体
真核载体
穿梭载体(sbuttle vector)指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间)。穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子,以确保两类细胞中都能扩增。
质粒载体按功能分:
高拷贝质粒:突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000扩增基因
低拷贝质粒:来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因
温敏质粒:在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质
测序质粒:含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker
整合质粒:装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合
探针质粒:装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选