细胞培养技术在生物研究域内是必不可少的核心环节,在培养过程中面临的一个严重问题就是细胞污染,其中支原体是主要的污染源。支原体在光学显微镜下不可见,而且被支原体污染的细胞培养基在一般情况下往往并不浑浊,细胞受损程度也不明显,形态很少改变,因此细胞被支原体污染后很难察觉。细胞一旦被支原体污染后,支原体会消耗细胞培养基中的营养物质,代谢产物不断积累,会导致细胞培养环境中pH值的改变,诱导或抑制某些细胞因子的表达,会影响培养细胞的代谢和增殖特征。

在日常工作环境中,支原体可以说无处不在,它可以通过人的毛发、口腔、穿着的衣服、动物的皮毛以及日常的细胞培养的操作环境造成对细胞的污染。能够造成细胞污染的支原体种类有很多,有些细胞甚至同时感染2种以上的支原体。由于支原体体积很小,直径约在0.2-2.0pm之间,可以通过滤膜而直接造成培养基或血清的污染。从形态结构上,支原体形态多变,多吸附在细胞表面或分散于细胞与细胞之间,是一类没有细胞壁的微生物,因此对作用于细胞壁类的抗生素(如青霉素)不敏感。

常用的检测方法有培养法、荧光染色法、PCR法和电镜观察法。

培养法是为可靠且成本低廉的方法,但培养周期较长,常用于细胞以及临床治疗细胞的支原体检査;

荧光染色法是用特异荧光染料(Hoechst 33258)染色后在荧光显微镜下进行检测,荧光染料(Hoechst 33258)是一种能和DNA特异结合物质,如果检测样品为支原体污染,则附在细胞表面和分散在细胞与细胞之间的支原体DNA着色,在荧光显微镜下可见;

PCR法检测是通过对支原体特定的序列设计引物,当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增,会将目标DNA特异性的复制,然后通过琼脂糖电泳观检测,会跑出条带出现阳性结果,反之当没有支原体污染时,由于没有模板,PCR无法扩增,则琼脂糖电泳跑不出条带,出现阴性结果;电镜观察法是利用电子显微镜的超放大功能,直接观察培养细胞中支原体污染情况。

在此主要介绍利用荧光染色法来检测培养细胞中的支原体,具体检测步骤如下:

(1)细胞爬片培养:待测细胞培养至传代水平,将细胞消化后接种至含有玻片的细胞板中,培养至60%-70%汇合时,进行检测;

(2)漂洗:将细胞板中的培养液吸出,取出玻片,用PBS轻轻漂洗;

(3)固定:加入适量的固定液,室温放置10min;

(4)漂洗:用PBS轻轻漂洗3次;

(5)染色:加入适量的荧光染料(Hoechst 33258)工作液,在室温下放置10min;

(6)漂洗:用PBS轻轻漂洗3次;

(7)镜下观察:将玻片晾干后,滴加抗荧光猝灭剂,于荧光显微镜下观察、拍照;