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一 、细胞表面标记的检测
1.试剂平衡至室温。准备:消毒台面;穿戴工作服,帽子,口罩和手套,放置棉签,草纸和有盖垃圾桶(内装有消毒剂)。
2.写编号纸并编号。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD33----CD14/CD454----
3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血,震荡,室温避光20分钟。加血摇匀血样。
4.加入溶血素1ml,震荡后室温避光10分钟。
5.离心,1200转, 5分钟。弃上清,震荡。
6.加入PBS洗液2ml,震荡,离心,1200转, 5分钟。弃上清,震荡。
7.加入PBS 900l。上机4度保存。
8.上机。
二 、细胞内细胞因子的检测
1.准备:消毒台面;穿戴工作服,帽子,口罩和手套,放置棉签,草纸和有盖垃圾桶(内装有消毒剂)。
2.写编号纸并编号。IgG1/ CD8/CD3IFN-gamma; /CD8/CD3
3.(3-5在超净台操作)取出PMA(1∶100),BFA(1∶10)和离子霉素(1∶10),使用无菌无叠氮钠PBS稀释储存液。
4.刺激:取全血或PBMCs(细胞数在0.5-1 106 )50l/管,再加入50l RPMI1640进行稀释一倍,加入刺激剂PMA,离子霉素和BFA,混匀。后在全血中的终浓度:PMA:50ng/ml离子霉素:1g/mlBFA:10g/ml。
5.37℃,5% CO2 ,4小时孵育(好用培养箱,松盖) 。
6.胞外染色:各管中加入相应的表面抗体20l和激活的全血100l混匀,室温避光20分钟。
7.溶血:每管加入溶血素2ml,室温避光10分钟。离心,1200转, 5分钟。弃上清。
8.破膜通透:每管加入0.5ml通透剂,室温避光10分钟。加入2mlPBS,1000转,离心5分钟。弃上清。
9.胞内染色:加入IFN-gamma;或IgG1的抗体20l,混匀,室温避光30分钟。加入2ml PBS,1000转,离心5分钟,弃上清。
10.加入PBS 500l。上机4度保存。
11.上机检测。
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