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酵母RNA的提取及组份鉴定(稀碱法)
阅读次数:906 发布时间:2022/3/31 13:08:58
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实验原理
由于RNA的来源和种类很多,因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出,此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA,用这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA,主要用作制备核苷酸的原料,其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液,90℃提取3-4h,迅速冷却,提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%,而DNA含量仅为0.03-0.516%,为此,提取RNA多以酵母为原料。


RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解,从水解液中可用定糖,定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。

试剂和器材
一、试剂
0.04M NaOH溶液;95%乙醇;1.5M硫酸;浓氨水;0.1M硝酸银。
酸性乙醇溶液:30mL乙醇加0.3mL HCl。
三氯化铁浓盐溶液:将2mL 10%三氯化铁(FeCl3· 6H2O)溶液加入400mL浓HCl。
苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液:称取6g苔黑酚溶于95%乙醇100mL。

定磷试剂:
17%硫酸:将17mL浓硫酸(比重1084)缓缓倾入83mL水中;
2.5%鉬酸铵:2.5g鉬酸铵溶于100mL水中;
10%抗坏血酸溶液:10g抗坏血酸溶于100mL 水,棕色并保存溶液;
临用时将三种溶液和水按下列比例混合:
17%硫酸:2.5%鉬酸铵:10%抗坏血酸:水=1:1:1:2(V/V)。

二、材料
干酵母粉。

三、器材
移液管0.2mL(×1),2.0mL(×1), 1mL(×4); 量筒10 mL(×1), 50mL(×1); 滴管;水浴锅;离心机。

操作方法
一、酵母RNA提取
称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶,沸水浴加热30min,冷却,转入离心管。3000转/分,离心15分钟后,将上清慢慢倾入 10mL酸性乙醇,边加边搅动。加毕,静置,待RNA沉淀完全后,3000r/min离心3min。弃去上清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后,用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤,沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量,计算:

二、RNA组份鉴定
取2g提取的核酸,加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液,然后进行组份鉴定。
1.嘌呤碱:取水解液1mL 加入过量浓氨水。然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。
2.核糖:取水解液1mL,三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。
3.磷酸:取水解液1mL,加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。

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