一、实验目的和原理

目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术

内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。交联剂为戊二醛，载体为甲壳素。

二、实验器材

1．恒温水浴锅

2．恒温振摇仪

三、实验试剂

1. 5%戊2醛

2. 甲壳素

3. 碘原液：称取碘1.1g。碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，后定容至50ml。摇均后放于棕色试管中备用。

4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。

5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。

6. pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。

7. 标准终点色溶液，

A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重洛酸钾（K2GrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml.

B液:：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml.

同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天内使用有效。

四、实验操作

（一）酶液的制备

精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。

（二）固定化酶的制备

1. 称取50mg粉末甲壳素，加入5%戊二醛10ml，调节pH=8.5，搅拌均匀后，于25℃，恒温振摇1小时。取出后，倾去戊二醛，然后以蒸馏水洗涤，倾去清夜，以除去多余的交联剂。

2. 取面制备的酶液10ml，与上述处理的甲壳素混合均匀，25℃，恒温振摇1小时，然后4℃冰箱放置过夜。

1.取出后，4000rpm离心分离，倾去清液，蒸馏水洗涤，可得固定化酶。

（三）固定化α-淀粉酶活力测定及活力回收率的计算

1. 先用吸管取1ml的标准终点色溶液，加至白瓷板的空穴内，作为终点参照的标准。

2. 固定总酶活力测定：取20ml 2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将试管置于60℃水浴5分钟。然后加入面制备的酶液0.5ml。摇匀后，立即用表记录时间。此后，每经一段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。

3. 固定化酶活力测定：取20ml 2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将试管置于60℃水浴5分钟。然后加入面制备的固定化酶。摇匀后，立即用表记录时间。此后，不断振摇，每经一段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。

4. 酶活力计算：以60℃、pH6的条件下，每小时水解1g淀粉的酶量为一个活力单位。

固定原酶活力单位 = 60/T×20×2%×n/0.5

固定后的酶活力单位 = 60/T×20×2%×n/10

T：反应到终点时的时间（分）

n：酶粉稀释的倍数

5. 固定化后酶活力回收率计算：

酶活力回收率=（固定后的酶活力单位/固定原酶活力单位） × 100%

五、注意事项

测定酶制剂时，应先在40℃水浴中悬浮2小时，再用纱布过滤。每次操作所用的纱布数要一致。