分子诊断是指通过分子生物学的检测手段，检测患者体内基因结构或表达水平的技术。由于其检测速度快、灵敏度高和特异性强等特点，被广泛应用于血液筛查、 遗传性疾病、传染性疾病、肿瘤伴随诊断等域。比如现与我们息息相关的新冠核酸检测，就属于分子检测的应用实例。分子诊断的检测往往需要标准品，作为对照，校正系统误差，确保结果的准确性。下面远慕生物就和大家分享分子诊断的背景知识和标准品的应用意义吧！应用于分子诊断中的检测技术

分子诊断主要检测基因的序列结构和表达水平，主要的检测技术包括PCR、高通量测序、荧光原位杂交（FISH）、基因芯片等。其中，PCR与高通量测序等应用为广泛。

PCR技术的原理是以样品DNA为模板，在聚合酶、引物和dNTP等扩增体系下复制出大量的子代DNA。代PCR通常在扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，一般需要结合一代测序才能对基因型做定性分析。第二代荧光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，在反应体系中加入荧光物用于指示反应进程，利用荧光信号的变化来监测扩增产物的变化，通过荧光曲线来判断结果，并可以借助Cq值和标准曲线来定量。第三代PCR 微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）也用于定量分析，相比于二代PCR灵敏度更高，能测定基因拷贝数。其原理是将反应体系分为成千上万个纳升的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经过扩增后，再通过检测荧光信号，并根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例计算出模板数量。

二代测序由于通量高，在检测多个样品和多个位点时，能节省时间、降低成本，所以在分子诊断中有巨大的应用潜力。其原理是通过模板DNA 分子的化学修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片上，利用碱基互补配对原理，在 DNA 聚合酶链反应或 DNA 连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实现碱基序列的解读，一次性可完成几十万至上百万条序列的测定。

分子诊断的应用域

分子诊断的应用场景很多，如主要应用的域有无创产检测（NIPT）、伴随诊断、肿瘤早筛和传染病检测等。

NIPT是通过高通量测序等手段，检测母体内的胎儿遗传信息，判别胎儿是否患染色体异常疾病，包括21 三体综合征（唐氏综合征）、18 三体综合征（爱德华氏综合征）、13 三体综合征 （帕陶综合征）。NIPT具有检测准确率高、周期短、漏诊率低和对母体损害低等优点。

伴随诊断是分子诊断的另一个应用域。在使用分子靶向药，需要先检测患者是否存在药物靶点，提高用药的准确性。常用的检测方法有PCR、NGS、FISH和免疫组化（IHC）等，其中PCR测序是常用的检测手段，具有快捷准确等特点。

在肿瘤早筛中也会应用到分子诊断技术。肿瘤形成的其中一个重要原因是基因突变。因此尽早筛查出这类人群，开展预防和治疗是很重要的。现阶段多通过内镜、组织活检等手段检测，但操作麻烦、准确性不高且存在漏筛。而基于 PCR、NGS 等分子诊断技术的液体活检则具有很大的应用潜力，其原理是通过检测从转移灶释放到血液中的肿瘤细胞或者DNA。具有取样方便、灵敏度高、非侵入性、有效应对肿瘤异质性、在疾病发展的不同阶段可重复取样等优势。

分子诊断在传染病筛查的应用主要体现在新冠检测和血液筛查。在新冠筛查中，主要应用qPCR检测，能快速准确地筛查出感染者，是减少新冠传播的有力手段，具有精准度高和辨识度强等特点。血液筛查是为了确保血液制品的质量、避免交叉污染和保护工作人员的安全，防止相关疾病的感染者进入供血队伍。这些疾病包括：人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒 （HCV）、梅毒螺旋体、丙氨酸氨基转移酶（ALT）等。早期以酶免检测（ELISA 技术）为主，但是灵敏度低。而以 PCR 技术为主的核酸检测（NAT）具有更高的灵敏性和特异性，能显著降低输血感染病毒带来的风险。

标准品在分子诊断中的应用

分子诊断的流程具有多个环节，从样品样本提取到变异检测，每个环节都存在不确定因素和不可规避的系统误差，这使得分析结果存在假阳性或假阴性的可能。因此需要标准品，来检测与校对分析体系的准确性。

分子诊断标准品应该具备以下3个特征:

1.  代表性。标准品需要与待测样品在基因遗传背景、细胞类型、组织类型和处理方式等方面高度相似，才能模拟待测样品的检测过程，以分析实验体系的精准度和判别待测样品结果。

2. 可量化。标准品需要具备突变频率阶梯性，将编辑细胞与野生型细胞以不同比例混合，用于模拟不同疾病或检测系统的检测上下限。

3. 持续稳定。标准品需要能持续且稳定生产。

在PCR检测变异的流程中，可以用标准品来验证试剂盒的提取效率、变异检测的准确度、试剂盒的灵敏度等。在核酸提取步骤中，样本经过不同的处理往往对核酸提取率有影响，比如经过福尔马林、石蜡包埋等处理等。如果存在与患者样本处理方式、材质、细胞复杂性和结构特性相似的标准品，例如FFPE标准品，则可以在提取环节中得知提取效率。如果更换提取体系时，只要使用相同的标准品，还可以比较不同提取体系的提取效率。同理，标准品在文库构建阶段和测序阶段也发挥着相同的作用，用于确定建库效率和测序质量。

生信分析位点变异情况时，由于标准品的突变位点、突变基因型和突变频率等信息都是通过人为修饰且已知，所以如果信息分析流程得出的变异检测结果与此不符，就需要调整参数，以得到准确的分析体系，同时还能准确判断患者样品的实际变异情况。

点突变细胞在分子诊断中的应用

基因点突变通常指单个碱基的替换或插入缺失。随着CRISPR-Cas9技术的发展与应用，不管是基于同源重组（HDR）或单碱基编辑系统的基因点突变修饰变得更加容易实现。全球有超过50000种人遗传疾病，其中大部分是由基因组的点突变引起的。例如罕见病，点突变引起的占了50%。对于这些疾病的分子诊断就显得更为重要。同样的，这些基因点突变疾病的分子诊断也会面临上述的问题：需确保分析体系的准确性。此时以点突变细胞作为分子检测的标准品，便可以解决。

小结
随着精准医疗的概念不断深入人心，分子诊断越来越贴切我们的生活，同时由于技术的不断发展，PCR、高通量测序等技术的灵敏度、精确性和成本都不断再改善，促使分子诊断行业快速发展。但由于检测系统存在不可消除的系统误差或不确定因素，检测结果可能出现假阳性或假阴性。那么设置分子诊断标准品，消除系统误差则显得十分重要。