实验方法原理
去除 5＇ 端的磷酸基可防止质粒 DNA 的自身连接和环化。在体外连接反应中，DNA 连接酶可在邻近的两个分子间形成磷酸二酯键。但只有当一个分子的 5＇ 端带有磷酸基另一分子的 3＇ 端带有羟基时，这一反应才能完成。

实验材料 小牛肠碱性磷酸酶（CIP) 或虾碱性磷酸酶（SAP)蛋白酶 K限制性内切核酸酶载体 DNA

试剂、试剂盒 EDTAEGTA乙醇酚氯仿 SDSTETris-Cl

仪器、耗材 琼脂糖凝胶水浴实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)，EGTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)，乙醇，酚，酚：氯仿（1:1，V/V)， SDS (10%，m/V)，乙酸钠（3 mol/L pH 5.2 和 pH 7.0)，TE ( pH 8.0)，Tris-Cl ( 10 mmol/L，pH 8.3)。

2. 酶与缓冲液

小牛肠碱性磷酸酶（CIP) 或虾碱性磷酸酶（SAP)，蛋白酶 K ( 10 mg/ml)，限制性内切核酸酶。

3. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.7%)，用含有 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 TBE 制备。

4. 核酸和寡核苷酸

载体 DNA ( 闭环质粒）。

5. 用设备

可调至 56℃ 或 65℃ 的水浴。

二、操作方法

1. 用 2~3 倍过量的限制酶消化一份合理量（10 μg) 的闭环质粒 DNA 1 h。

2. 取出一小份（0.1 μg) DNA，用含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶（0.7%) 电泳检査消化程度，用未被消化的质粒 DNA 作对照。如消化不完全，应添加更多的酶继续消化。

3. 如已消化完全，用酚：氯仿抽提一次，再用乙醇沉淀回收 DNA。将乙醇溶液置于冰上 15 min。

4. 于 4℃ 用大转速离心回收 DNA，用 110 μl 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3) 溶解 DNA。保留 20 μl 的 DNA 以备以后用作对照。

5. 向余下的 90 μl 线状 DNA 中加入 10 μl 10X CIP 或 10X SAP 缓冲液和适量的小牛肠碱性磷酸酶（CIP) 或虾碱性磷酸酶（SAP) 并按表 1-8 中的方法进行温育。

6. 灭活磷酸酶：

灭活 CIP：在达到温育时间后，加入 SDS 和 EDTA ( pH 8.0) 使终浓度分别为 5% 和 5 mmol/L，充分混匀，再加入蛋白酶 K 使终浓度为 100 μg/ml，于 55℃ 温育 30 min。也可在 5 mmol/L EDTA 10 mmol/L EGTA ( pH 8.0 ) 存在的条件下于 65℃ 温育 30 min 使 CIP 失活（或 75℃ 10 min)。或失活 SAP：在去磷酸化缓冲液中使反应混合物于 65℃ 温育 15 min。去磷酸化反应结束后，在进行连接反应去除或使碱性磷酸酶完全失活是很重要的。尽管 CIP 或 SAP 都可通过上述方法失活，但我们仍建议在使用去磷酸化的 DNA 进行连接之好用酚：氯仿抽提一下去磷酸化反应的混合物。

7. 使反应混合物冷至室温，而后用酚抽提一次，再用酚：氯仿抽提一次。

8. 用乙醇沉淀法回收 DNA。再次混匀溶液，置于冰上 15 min。

9. 于 4℃ 用大转速离心回收 DNA，用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，于 4℃ 再次离心。

10. 小心弃去上清液，将开盖的离心管置于工作台直至乙醇蒸发殆尽。

11. 用 TE ( pH 8.0) 溶解沉淀的 DNA 使浓度为 100 μg/ml。以小份分装 DNA 于 -20℃ 保存。