关于RNA提取时RNA降解的原因

1 ) 新鲜细胞：

裂解液的量不足，使得裂解不充分。

2 ) 新鲜组织：

某些含有内源性核酸酶的样品，很难避免RNA酶的降解，建议采用的方法为在液氮条件下将组织研碎，并且，匀浆时采用更多的裂解液。

3 ) 冷冻样品：

样品取材后应该迅速置于液氮中冷冻存放，然后转移到-70℃冰箱存放。如果未经液氮速冷直接转移到-70℃冰箱存放，会造成RNA缓慢降解。样品研磨后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。

4 ) 外源 RNA 酶的污染：

试剂、器械等实验用品应该采用DEPC 水灭菌处理。

5 ) 内源 RNA 酶的污染：

抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多或者匀浆温度过高。

RNA提取得率偏低原因分析

1 ) 组织或细胞中 RNA 含量偏低：

不同细胞或者组织中RNA的丰度不一样，RNA提取量也不一致。

2 ) 样品起始量太少或者太多：

样品起始量太少，则细胞组织中RNA含量较低，样品过多则超过裂解液的裂解能力，使得裂解不完全，从而RNA得率低。

如何从冻存的细胞提取RNA

1). 将冻存管从液氮或冰箱中取出；

2). 不待细胞溶解，将Trizol500ul-1ml直接放入冻存管中，此时Trizol会冻成冰状；

3). 将冻存管缓慢融化，并用加样器吹打混匀；

4). 将细胞裂解液移至Eppendorf管中，16000′g离心1min，吸出管底絮状沉淀;

注释：该步骤并非必要，多数Protocol省略该步骤，但加入该步中能明显提高RNA的质量；注意不能离心时间过长，否则沉淀难以吸出，将200ul黄枪头尖部切去0.5cm操作；

5). 加入1/5体积的氯仿（约200ul）,上下颠倒2~3min；

6). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻吸出上清至新的Eppendorf管（约700ul ），不要扰动中间层或用手指使Eppendorf管变温；

注释：一般情况下提取的RNA已经足够，而且在逆转录过程中RNA的质量要远较RNA的数量更重要，一般仅取上清的上1/2左右足矣，这样可大限度避免对于中间蛋白相的扰动；

7). 加入等体积异丙醇（约800ul）,充分混匀，冰上静置15min；

8). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；

9). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；

10). 倒置Eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇完全挥发；

11). 用100ul 新鲜制备的DEPC处理过的MilliQ 水溶解RNA，如果溶解不好，-20℃反复冻融1~2次，4℃ 16000′g离心3min，将上清吸至新的Eppendorf管中；

12). 加入等体积12 M LiCl，-20℃静置15min；

13). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；

注释：该步骤的目的在于去除小分子降解RNA和盐分；但可以省略；只有大分子RNA在高浓度LiCl中沉淀，DNA不会沉淀；

14). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；

注释：该步的目的在于去除LiCl，LiCl溶于乙醇，而RNA不溶于乙醇，利用溶解度分离；

15). 倒置Eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇完全挥发RNA边缘呈半透明；

16). 用40ul新鲜制备的DEPC处理过的MilliQ 水溶解RNA；

17). 取出5ul 用于紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳，其余冻存-70℃。

注释：如果OD260/OD280＜1.8，则加入等体积Trizol，按上述步骤重新提纯。