胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，作用对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。消化原代培养的上皮类细胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂.胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开,在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同,对细胞的消化能力也不同,胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等.

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害.该酶分离效果好,即使有钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,终浓度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用缓和,无需机械振荡,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本.

酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为 0.1%-0.25%（活力 1:200 或 1:250），但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

温度 一般认为胰蛋白酶在 56℃时活性强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为 37℃，通常在 37℃进行消化比室温作用快。

pH pH8~pH9 是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时 PH 只能选用 7.6~8.0 之间，否则对细胞有损伤。

无机盐离子 若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制时应采用无钙镁离子的 PBS 配制。

消化时间 如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为 20 分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于 4℃过夜也可。

分离方法如下：

①过夜冷消化 将取得的组织用 Hanks 液洗三次，剪成碎块大小为 4 毫米左右，用 Hanks 液洗 2~3 次以除去血球和脂肪组织，再加入 0.25% 的胰蛋白酶，摇匀后放 4℃过夜，次日再用 Hanks 液洗涤，弃去上清，共洗 2~3 次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三种：

热消化多次提取 －－ 将剪碎的细胞块加入 0.25% 胰蛋白酶 37℃水浴中消化 15~20 分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。

冷消化多次提取 －－ 方法同上，只是消化温度为 4℃。

先热消化后冷消化 －－ 将组织块先用胰蛋白酶于 37℃下消化 20 分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于 4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。

?胶原酶（Collagenase）消化法

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用 PBS 和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，终浓度 200u/mL 或 0.1~0.3mg/mL. 此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。

经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。

非酶消化法（EDTA 消化法）

EDTA 是一种非酶消化物，又称螯合剂或 Versene, 全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的 PBS 配成 0.02% 的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1 或 2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。

消化分离法的操作步骤：

（1）剪切 把组织块剪碎，呈 1~5mm3?大小的组织块。

（2） 加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁 PBS 洗 2-3 次（采用倾斜，自然沉降法）。

（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA）于 37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇 1~2 次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。

（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。

（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗 2-3 次后，加入完全培养基。

（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或 3~4 层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降 5~10 分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

注意事项如下：

（1）组织块必须漂洗 2-3 次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

（2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。

（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。

原代细胞的培养方法

原代细胞的培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞在体外进行的次培养，是建立细胞系的步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。

1、组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁 24 小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7 天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。

其培养方法如下：

（1）按照述方法取材，将组织剪成或切成 1mm3?大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。

（2）将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距 0.2 cm~0.5cm，一般在 25mL 培养瓶（底面积为 17.5cm2）可接种 20~30 小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在 37℃温箱内。

（3）培养 2~4 小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养 24 小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养 3~5 天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

原代细胞培养 -2

2、消化培养法

该方法是采用述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。

某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。

3、悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

4、器官培养

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。

1、器官培养的特殊的要求

（1）需要特殊的培养条件 因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过 1mm.

（2）器官内部细胞需要有足够的氧气渗入 常采用以下两种方法：

a. 将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。

b. 提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持 5% CO2, 以维持 pH.

2、器官培养的方法

（1）将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为 1/2 皿高，使其表面铺上 0.5mm 孔径的滤膜。

（2）将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。

（3）将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过 200μm, 水平面积不超过 10mm2, 如为肝、肾不能大于 1mm2.

（4）将培养物置于 CO2?培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达 90%, 培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。

（5）上述器官培养 1~3 周（每隔 2~3 天换液一次）后可用于实验和检测。