当你徘徊在如何选择二抗，或不知怎样选择合适的二抗时，你的眼神告诉我，你纠结了，但是这不是你的错。而当看完以下内容，你将不会再纠结，否则，那将是我的错。

1. 弄清一抗的宿主物种是什么

二抗指向一抗的物种。如果使用来源于兔的一抗，则需要来源于除兔以外的其它物种的抗兔二抗。例如山羊多克隆抗兔IgG 二抗可以检测兔多克隆抗 Ki67 一抗。换言之，二抗的宿主物种要求与一抗的宿主物种不同，而且种属亲缘关系越远越好。

2.了解一抗蛋白类型

二抗必须指向一抗同型。

多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴，并且是IgG 同型。二抗通常为抗 IgG 重链和轻链的抗体。单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠。例如，如果单克隆一抗为小鼠 IgG1，则 需要抗小鼠 IgG 或特异性较低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG。
人免疫球蛋白类、亚类、型和亚型：

· 类或同型：IgG (γ heavy chains), IgM (μ), IgA (α), IgE (ε), IgD (δ)

· 亚类： IgG1 (γ1 heavy chains), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4); IgA1 (α1), IgA2 (α2)

· 型：κ light chain, λ light chain

· 亚型： λ1, λ2, λ3, λ4
其它类型的反应：

· 多价抗体与所有免疫球蛋白类反应

· 抗 Fc 或重链 (α, δ, ε, γ, ａnd μ) 抗体仅与重链反应

· 抗 F(ab) 或完整分子抗体与重链和轻链反应，而与免疫球蛋白类无关

· 由于所有免疫球蛋白类均使用相同的 κ 和 λ 轻链，因此抗轻链（κ 和 λ）抗体 与所有免疫球蛋白类反应

3. 需要酶学或荧光检测吗？

偶联类型是依赖于应用的。

对于酶学和生物素检测，例如，在 WB 或 ELISA 中，建议将二抗偶联于 HRP, AP 或 生物素。不论抗体宿主物种是什么，抗生物素蛋白和链霉亲和素与生物素的结合作用均很强，并且均能使信号放大。 如果使用了激光，例如，在流式细胞术、ICC/IF 或 IHC 中使用时，则建议将二抗偶联于荧光染料进行荧光检测。

4.有必要使用 F(ab) 或 F(ab＇)₂片段抗体吗？

F(ab) ) 和 F(ab＇)₂片段抗体消除了抗体 Fc 部分与细胞（如巨噬细胞、树突细胞、 中性粒细胞、NK 细胞和 B 细胞）上 Fc 受体之间的非特异性结合，并且由于它们尺寸较小而能够更有效地渗透组织。由于片段抗体不具有 Fc 部分，因此它们不干扰抗 Fc 介导的抗体检测。

5. 是否需要亲和纯化的抗体或 IgG 片段？

使用亲和纯化的抗体或 IgG 片段的优点将取决于预期的结合类型。亲和纯化的抗 体的非特异性结合量低，而 IgG 片段包含高亲和抗体。事实上，在亲和纯化中， 高亲和力抗体保持固定在基质上并且不能被洗脱。

6. 是否需要预吸附的二抗？

对于富含免疫球蛋白的组织和细胞，通常推荐使用预吸附血清的二抗于蛋白质印 迹应用。预吸附的二抗与内源免疫球蛋白发生相互作用的可能性较低，因此可降 低非特异性背景。二抗进行预吸附时，预吸附样品应来源于与检测样品相同的物 种。例如，在人组织中检测时，将需要人预吸附抗体。

7. 是否需要抗 IgG 重链和轻链、抗轻链或抗 F(ab＇)₂ 二抗？

抗 IgG 重链和轻链的抗体同时与 IgG 亚类的重链和轻链反应

抗轻链抗体与在所有免疫球蛋白类中均相同的一抗轻链反应

抗 F(ab＇)₂ 二抗与一抗的 F(ab＇)₂ 部分反应