聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。
PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。
PCR法具有特异性强,灵敏度高,快速简便、纯度要求低等优点,但也存在一些假阴性、假阳性等问题。
PCR原理的图解PCR(生物学的聚合酶链反应)
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。到如2013年,PCR已发展到第三代技术。1973 年,台籍科学家钱嘉韵,发现了稳定的Taq DNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。
1、基本要素和扩增原理
基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。待拷贝的 DNA 称为模板,它可以是双链 DNA 也可是单链DNA,后扩增得到的产物是双链状态的。引物是 DNA 复制的先锋,就象结晶过程中的晶核,引导 DNA 的合成。在 PCR 扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA 聚合酶是 DNA 复制的动力,在 dNTP 等底物存在时在引物的引导下沿着模板 DNA 合成互补的 DNA 链。
2 、PCR 扩增的步骤
先将模板 DNA 置于 92℃ -96℃,进行变性(denaturation)处理,使 dsDNA 在高温下解链成为 ssDNA ,且热变性不改变其化学性质;然后退火(annealing) ,将温度降至 37℃ -72℃,使引物与模板的互补区相结合;后,在 72℃ 条件下, DNA 聚合酶将 dNTP 连续加到引物的 3'-OH 端,合成 DNA ,这个步骤称为延伸(extension)。这三个热反应过程的重复称为一个循环,经过 20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段。