实验材料： Taq DNA多聚酶引物 阳性对照 DNA脱氧核苷三磷酸 混合物三磷酸 琼脂糖1.3%TAE胶

试剂、试剂盒： 磷酸缓冲盐溶液液 Tris醋酸 EDTA6×加样缓冲液 引物储备液

仪器、耗材： DNA抽提和纯化系统基质的DNA抽提试剂盒 热循环仪

实验步骤

一、DNA 标本的收集和制备

1. 需要检测支原体污染的细胞系，在收集样品数天或至少在解冻后两周内，不能加任何抗生素。应保证支原体在培养上清中的效价在 PCR 测定范围之内。

2. 收集 1 ml 贴壁细胞或悬浮细胞的培养上清液。这样收集的标本包含活的或死的细胞，其优点是一些支原体会明显地黏附在真核细胞上，甚至侵入细胞中。上清液可贮存在4°C 数天或 -20°C 数周。在样品溶化后，应立即操作。

3. 上清液在 13000 g 离心 5 min，将沉淀用 1 ml D-PBSA （D-PBSA （磷酸缓冲盐溶液液）：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，1.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.2；121℃，20 min 高压灭菌）重悬浮，涡旋混匀。

4. 再次离心悬浮液，用 D-PBSA 冲洗一次以上，如步骤3。

5. 离心后的沉淀用 100 μl D-PBSA 重新悬浮，涡旋混匀，然后加热至90°C，15 min。

6. 在分解细胞后，采用标准酚/氯仿抽提法、乙醇沉淀法或其他 DNA 抽提方法立即抽提 DNA 。

二、PCR 反应

建立规则以避免 DNA 加入过多，严格按照以下步骤进行：

①DNA 抽提的地方和 PCR 进行的地方及 PCR 之后走胶的地方应分开；

②所有试剂应以小量分装以保证能恒定提供无污染的试剂；

③避免重复扩增（reamplification）；

④贮存只用于 PCR 操作的吸量管、吸头、试管，经常用紫外线照射；

⑤连续进行 PCR 操作，应严格按以下步骤进行；

⑥在样品制备及 PCR 进行的全过程，应戴手套操作；

⑦应包括相应的对照反应，内对照、阳性对照、阴性对照及水溶液对照。

1. 用以下溶液对每个样品进行二次测定

仅用于样品：1 μl NTPs，1 μl Myco-5＇，1 μl Myco-3＇，1.5 μl 10× PCR 缓冲液，9.5 μl 蒸馏水。

用于样品和内对照 DNA：1 μl NTPs，1 μl Myco-5＇，1 μl Myco-3＇，1.5 μl 10× PCR 缓冲液，8.5 μl 蒸馏水，1 μl 内对照 DNA，事先混合后贮存多份样品，三个样品用于无内对照反应（包括阳性、阴性及水溶液反应），两个样品用于有内对照反应，包括阳性、阴性对照，总体积要富余一些以弥补吸取过程的损失。

2. 将 14 μl 已混合好各种贮备液加入到 0.2 ml PCR 反应管，加入 1 μl 蒸馏水用作水对照反应。

3. 制备多聚酶混合液（每个反应 10 μl，再加额外 10 μl，以保证吸取足够量）。每个反应中含有 1 份 PCR 缓冲液和 1 单位 Taq 多聚酶。

4. 移去所有用于制备事先混合贮备液的试剂。

5. 取出欲测试 DNA 样品和阳性对照 DNA ，不要同时处理试剂和样品。

6. 加 1 μl DNA 制备液至一个不包含内对照 DNA 反应管内，另加 1 μl DNA 制备液至一个包含内对照 DNA 反应管内。

7. 进行热启动 PCR，将反应混合物（未加多聚酶）转移至加热反应器中，依照下面步骤进行一个加热周期；

步：95°C，7 min；

第二步：72°C，3 min；

第三步：65°C，2 min；

第四步：72°C，5 min 。

在第二步时，打开加热器盖子，加入 10 μl 多聚酶混合液至每个管内，如有许多样品则操作时间可能延长。打开或关闭反应管应分开进行，以避免样品的挥发。在继续进行下个周期步骤，在加入 Taq 多聚酶至后一个反应管和关闭加热器盖至少应有 30 s 以平衡温度以及移去盖上冷凝物。

8. 在开始笫一个周期后，按照以下参数进行 32 个加热周期：

笫一步：95°C，4 s；

笫二步：65°C，8S；

笫三步：72°C，16s；

每个周期再另外延 1 s 。

9. 72°C，10 min 完成后的扩增步骤，结束反应，然后将样品冷却至室温。

10. 制备一个含有 0.3 μl 溴化乙啶 /ml 的 1.3% 琼脂糖-TAE 胶，胶上用 1×TAE （50× TAE（Tris 醋酸 EDTA）： 2 mol/L Tris 基液，5.71% 冰醋酸（V / V），100 mmol/L EDTA，调节 pH 至 8. 5）覆盖，每孔加入 12 μl 扩增产物（10 μl 反应混合物，2 μl 6× 加样缓冲液（6× 加样缓冲液：0.09% （W / V），溴酚蓝，0.09% （W / V）二甲苯蓝FF，60 % 甘油（V / V )，60 mmol/L EDTA）），10 V/cm 开始电泳。

11. 紫外线扫描显示特异产物，记录扩增结果。