怎样提高扩增效率和PCR的特异性?
阅读次数:369 发布时间:2023/5/8 10:49:01
引物
引物设计:引物长度适当,18-24mers,并保证序列独特性,以降低序列在非目的片段中存在的可能性,但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性,较长的序列可能会与错误配对序列杂交,反而降低特异性,而且长序列比短序列杂交慢,影响产量; 引物浓度:引物的浓度会影响特异性。佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。
Mg2+
较高的Mg2+浓度可以增加产量,但也会降低特异性。为了确定佳浓度,从1mM到3mM,以0.5mM递增,进行适Mg2+浓度测定。
退火温度
Tm对于设定PCR退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的Tm低5℃的温度。合理的退火温度为55-70℃。在理想状态下,退火温度应足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。
巢式PCR
使用巢式引物进行连续多轮扩增,由于同两套引物都互补的靶序列很少,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性,从而提高PCR反应的特异性和灵敏度。
递减PCR
通过在PCR的几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1℃到2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。这样,特异性高的目的模板会被优先扩增,并在随后的循环中继续扩增占据优势。
热启动PCR
通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR 仪达到变性温度。常用的是热启动DNA 聚合酶,常温时该酶活性被抑制,94-95℃加热数分钟后回复正常活力开始反应,这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增,大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性重要的方法。
PCR增强剂
包括甲酰胺,DMSO,甘油,甜菜碱等,能构降低熔解温度,从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二结构区。