实验概要

本实验介绍了根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备及冻融法转化。

主要试剂

利福平，LB培养基，NaCl，CaCl2，YEP培养基，卡那霉素

主要设备

摇床，高速离心机，低温冰箱，水浴锅

实验材料

根癌农杆菌GV3101单菌落

实验步骤

1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备

1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；

2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；

3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；

4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；

5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；

6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。

2. 冻融法转化农杆菌

1) 冰浴融化农杆菌LBA4404/GV3101感受态细胞；

2) 加入3ul表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1 min，然后在37℃水浴5min；

3) 加入950uL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；

4) 1 0000rpm离心1 min以浓缩菌液，用100uL YEP回溶菌体；

5) 将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃培养36-48h。菌液PCR检测阳性克隆。