为了避免杂菌污染，获得微生物纯培养物，培养基必须及时严格灭菌。通常采用高压蒸汽灭菌。一般培养基用0. IMPa (121℃)维持15 ~ 30min即可彻底灭菌。长时间的高温灭菌会使某些不耐热的物质破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖。因此，含糖培养基常用0.05MPa (110℃) 灭菌20 ~ 30min某些对糖类要求更高的培养基，可先将糖过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合。长时间高温灭菌也会使磷酸盐、碳酸盐与钙、镁铁等阳离子形成难溶性化合物而产生沉淀。为了防止这类沉淀发生，可将这些物质分别灭菌，冷却后再混合；也可在培养基中加入少量整合剂(0.01%乙二胺四乙酸，即EDTA)使金属离子形成可溶性络合物，防止沉淀的产生。高压蒸汽灭菌一般使培养基 pH降低， 应在配制培养基时加以调节。

干热灭菌和湿热灭菌,干热灭菌方法：包在铁质容器内,进行高温烘烤.湿热用牛皮纸包起来放在高压锅中进行高压灭菌.

湿热灭菌、煮沸灭菌和过滤除菌,煮沸灭菌在电磁炉或者微波炉内进行煮沸即可,过滤除菌适用于不能高温处理的培养.

高压蒸汽灭菌：

高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。培养基在爱制备过程中混入各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h内完成灭菌工作。灭菌时一般是在0.105MPa压力下，温度121℃时，灭菌15~30min即可。消毒时间不宜过长，也不能超过规定的压力范围，否则有机物质特别是维生素类物质就会在高温下分解，失去营养作用，也会使培养基变质、变色，甚至难以凝固。

可将蒸馏水或自来水装在三角瓶中，装水量一般不超过瓶的2/3，用牛皮纸或硫酸纸包扎封口，然后放入高压锅中灭菌后即为无菌水。 灭菌后的培养基可放到培养室中预培养3d，若无污染现象，则证明灭菌是彻底的，可以使用。暂时不用的培养基好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培养基应在1周内用完，其他培养基多也不要超过1个月。

过滤灭菌：

一些植物生长调节剂及有机物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇热容易分解，不能与培养基一起进行高温灭菌，而要使用细菌过滤器滤去其中的杂菌。细菌过滤器与滤膜（孔径0.45微米）使用之要行高压灭菌。过滤后的溶液要立即加入培养基中，若为液体培养基，可在培养基冷却至30℃时加入；若为固体培养基，必须在培养基凝固之（50-60℃）加入，振荡使溶液与其他成分混合均匀。