菌种在分离、保藏和生产过程中，易遭致杂菌污染，因此必须对染有杂菌的菌种进行提纯，方能用于生产。根据污染的类型和程度，需采用不同的纯化措施。

（1）排除细菌或酵母菌污染

在菌种培养中，用肉眼仔细观察培养基表面，不难发现被细菌或酵母菌污染的分离物常出现黏稠状的菌落。取被纯化物接种在无冷凝水、硬度较高（琼脂用量2.3%～2.5%）的斜面上，再降低培养温度至15～20℃，利用某些大型真菌在较低的温度下，菌丝生长速度比细菌蔓延速度快的特点，用尖细的接种针切割菌丝的端，转接到新的试管斜面培养基中培养，连续2～3次就能获得所要的纯菌丝。也可打破试管，挑取内部长有基内菌丝的琼脂块，移入无冷凝水的培养基上，该法适于被好气性细菌污染的母种。

（2）排除霉菌污染

霉菌和细菌不同，它和食用菌菌丝很相似，也有气生菌丝和基内菌丝。分离的方法主要是抑制杂菌生长，拉大食用菌菌丝生长和杂菌菌丝生长的范围差，从食用菌菌落端切割，移植入新培养基。杂菌发现越早，分离的成功率越大。严格地说，在斜面培养基上的非接种部位发现的白色菌丝，应认为是杂菌菌落，应马上提纯。若有色孢子已出现，一方面易使分生孢子飘散，另一方面其基内菌丝早已蔓延，可能和食用菌菌丝混生一起。如霉菌刚出现孢子且尚未成熟、变色，则可采用端菌丝切割法提纯。转管时先将菌丝接种在斜面尖端，当长满斜面后，及时将原接种点连同培养基一起挖掉；如霉菌菌落颜色已深，说明孢子已成熟，稍一振动孢子就会飘满培养基，若再行上法意义不大。如菌丝蔓延范围较大，可将0.2%升汞溶液或1%多菌灵处理过的湿滤纸块覆盖在霉菌的菌落上，可抑制霉菌生长，防止孢子扩散，后用灭菌接种铲将表层铲掉，随之用接种针钩取基内菌丝移入新的培养基，如此2～3次。

（3）限制培养

取直径7～10毫米、高4～6毫米的玻璃环或不锈钢环，经酒精灯火焰灼烧后趁热放到斜面培养基中央，将环的一半嵌入培养基内，然后将染有细菌的接种块放入环内进行培养。细菌生长会被限制在环内，而食用菌菌丝则可越过环而长到环外的培养基上，转管后即可得到纯化。

（4）覆盖培养

在污染了细菌的食用菌菌丝斜面上倾注一层厚约2毫米的培养基，培养一段时间，当食用菌菌丝透过培养基形成新的菌落时，即可切割转管。好进行二次覆盖。

（5）基质菌丝纯化培养

对棉塞长有霉菌的试管斜面，可将试管打碎，取出培养基，用0.1%升汞浸泡2分钟，用无菌水淋洗，再用无菌滤纸吸干。取一段2厘米的培养基从中部切开，在断面上用无菌刀片切成米粒大小的块，移入新的斜面上进行培养。

（6）药物处理

菌种提纯时，可向培养基中注入选择性强的抗菌制剂，如加入 5～10毫克/升的多菌灵（MBC）、涕必灵（TBZ）或托布津等，可有效地防止菌霉混生；在每毫升培养基中加入30～40毫克链霉素、20～30毫克四环素、金霉素，或50毫克高锰酸钾，可以有效地防止细菌混生；加入灰黄霉素（20单位/毫升），可抑制真菌生长。

（7）破碎菌丝

从试管中取出已污染的培养基，放在0.1%升汞水中处理2分钟，用无菌水冲洗，无菌纸吸干，再放入有玻璃珠的无菌水内，经组织破碎，稀释后注入平板培养，取其单个菌落纯化培养。