质粒提取实验常见问题分析
阅读次数:454 发布时间:2024/3/8 10:21:02
质粒提取原理
现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法,两种方法较为剧烈,适用于较小的质粒(<15Kb),而去污剂裂解法则比较温合,一般用于分子量较大的质粒(>15Kb)。
碱裂解法是一种广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为:染色体DNA远远大于质粒DNA,染色体DNA为线状分子,而质粒为共价闭合环状分子。当pH 12.0-12.6碱性环境中,线性的大分子的染色体DNA完/全变性,而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可以恢复其天然构象,在高盐浓度存在的条件下,染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态,通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA仍在上清中。
质粒提取常见问题分析
1、影响质粒提取的因素有哪些?
质粒提取的得率和质量与很多因素有关,如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。
2、为什么从革兰氏阳性菌中提取质粒要在悬浮液中加入溶菌酶?
革兰氏阳性菌有一层细胞壁,必须加入溶菌酶才能使之溶解。
3、如何根据实验需要选择不同别的产品?
从纯度上:各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化,普通纯度的质粒可以满足要求;而对于转染实验,则要求使用高纯度质粒提取试剂盒方能满足要求。
从提取的量上:1-20μg,应选择小量提取试剂盒;20-40μg,应选择中量提取试剂盒;大于40μg,应选择大量提取试剂盒。
从宿主菌上:分为普通细菌质粒提取试剂盒、G+菌质粒提取试剂盒和酵母菌质粒提取试剂盒,根据情况进行选择。